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目的:阐明清肺通络膏组方的理论基础及穴位贴敷的应用理论;采用呼吸道合胞病毒(RSV)诱导大鼠肺炎模型,研究清肺通络膏对RSV诱导的TLR4信号传导通路的调控作用,探讨其治疗RSV肺炎的可能免疫学机制;探讨清肺通络膏全药膏及君臣药膏干预RSV肺炎大鼠TLR4信号通路时效性关系,为临床防治RSV肺炎提供实验依据。材料与方法:1.采用鼻腔接种RSV Long株法诱导幼龄Wister大鼠肺炎模型,结合大鼠一般状态、肺组织病理切片、形态学、肺指数等指标,观察正常组和模型组大鼠各方面的差异,并应用Realtime-PCR技术检测大鼠肺组织中不同时间点的病毒载量基因水平,从多个角度进行模型评价。2.将清肺通络膏外敷在幼龄大鼠背部(等同于外敷在大鼠的肺腧等穴位)作为给药的途径对RSV诱导的肺炎大鼠模型进行干预,在不同时点对各组大鼠的一般状态、体重及肺指数的差异性进行比较研究。3.采用免疫组织化法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测RSV诱导大鼠肺炎的肺组织和血清中细胞因子TNF-α、IL-6的蛋白表达水平及蛋白含量,同时比较研究全药组和君臣组干预RSV肺炎大鼠不同时间点细胞因子的差异性。4.采用免疫组织化法和RT-PCR技术检测RSV诱导肺炎大鼠的肺组织中TLR4和NF-κB P65的蛋白及m RNA的表达,探讨清肺通络膏对RSV肺炎幼龄大鼠的防治作用机制,同时比较研究全药组和君臣药组干预RSV肺炎大鼠TLR4信号通路不同时点活化程度的差异性。结果:1.各组大鼠体重比较结果:正常组大鼠的体重成稳步上升趋势,模型组体重增加则较为缓慢,造模第4天开始,正常组与模型组大鼠体重比较体重增加有显著的差异性(P<0.05),全药组和君臣药组大鼠的体重稳步增加,但较正常组大鼠体重增加的缓慢。造模第5天起,全药组与模型组大鼠体重比较具有显著性差异(P<0.05);与同时间点的正常组比较有显著的差异性(P<0.05);与君臣药组大鼠体重比较无明显差异。造模第7天开始,全药组和君臣药组大鼠体重有显著性差异(P<0.05)。2.RSV感染后肺部病理改变结果:正常组小鼠在任何时点肺组织外观全肺野无病变。造模第5天后,光镜下观察模型组大鼠肺组织显示上皮细胞有破损,肺泡壁血管扩张充血,肺泡壁展现不同程度的增厚,间质水肿增厚,肺泡内可见大量炎细胞浸润以及浆液的填充,以淋巴细胞为主。电镜下观察模型组肺组织肺泡壁增厚,肺泡腔内可见坏死脱落的细胞,间质细胞数量增多,可见Ⅱ型肺泡上皮细胞粘膜上皮纤毛破碎,上皮细胞变性、坏死。随着感染时间的延长,肺部病变的程度逐渐加重。敷药组大鼠肺内炎症表现与模型组比较均有不同程度的减轻。3.肺组织不同时点RSV-RNA的半定量测定结果:实时采用RT-PCR,正常组大鼠各时间点肺组织中未检测到RSV病毒核酸。在大鼠感染3~7天的模型组大鼠肺组织中发现RSV-RNA扩增表达,表达随着病毒载量的增加而增加,提示病毒的感染量同炎症的损伤成正比规律。4.肺指数结果:、正常组大鼠在不同时间点的肺指数均是最低。模型组与正常组比较,肺指数升高明显,具有显著性差异(P<0.01);全药组与模型组比较,肺指数降低明显,具有显著性差异(P<0.01);君臣药组与模型组比较,肺指数有所降低,具有显著性差异(P<0.05);全药组大鼠的肺指数比君臣药组的肺指数下降明显;全药组和君臣药组与正常组比较,肺指数均有不同程度的升高,均具有显著性差异(P<0.05)。5.各组大鼠肺组织中IL-6和TNF-α蛋白表达情况正常组可检测到少量的IL-6和TNF-α蛋白表达。模型组IL-6和TNF-α蛋白表的随着时间的延长,分泌逐渐开始增多,在造模的第7天的积分光密度值分别达到33.874±2.1762和13.8927±0.5485,与同时间点的正常组的蛋白表达水平比较有显著性差异(P<0.01)。全药组和君臣组分别与同时间点的模型组比较,IL-6和TNF-α蛋白表达均低于模型组,且均高于正常组,且有显著性差异(P<0.05);二者分别于模型组比较,在第3天无明显差异性(P>0.05),在第5天和第7天,均有显著性差异(P<0.05);各时间点,全药组与君臣组二者比较,第3天无显著性差异(P>0.05),第5天和第7天有显著性差异(P<0.05),提示全药组在第7天效果最佳。6.各组大鼠血清中IL-6和TNF-α蛋白含量情况正常组可检测到少量的IL-6和TNF-α蛋白表达。模型组中IL-6和TNF-α蛋白的含量呈上升趋势,造模第7天升到最高值,达到400.48±10.42、175.27±9.76;与同一时间点正常组比较,均有显著性差异(P<0.05)。各时间点,全药组和君臣组血清中IL-6、TNF-α蛋白含量虽与模型组比较均有所下降,但仍高于正常组;在造模第5天和第7天,全药组和君臣组IL-6、TNF-α蛋白含量分别与模型组比较,均有显著性差异(P<0.05)。全药组与君臣组在同一时间点比较,在造模第7天出现显著性差异(P<0.05),提示全药组在第7天药效发挥最明显,效果最佳。7.各组大鼠肺组织中TLR4蛋白表达情况正常组可以检测到少量的TLR4蛋白表达,各时间点比较均无显著性差异(P>0.05)。模型组肺组织中TLR4蛋白表达持续升高,在造模第7天蛋白含量的表达达到最强;与相同时间点的正常组比较,具有显著性差异(P<0.01)。在各个时间点,全药组TLR4蛋白表达均高于正常组,具有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,在造模第5、7天变现出显著的差异性(P<0.05)。君臣组在不同时间点TLR4蛋白表达均低于模型组,且高于正常组,均具有显著性差异(P<0.05);与全药组TLR4蛋白表达比较,在第7天蛋白表达具有显著性差异(P<0.05)。8.各组大鼠肺组织中NF-k Bp65蛋白表达情况正常组可以检测到少量的NF-k Bp65蛋白表达,各时间点比较均无显著性差异(P>0.05)。模型组肺组织中NF-k Bp65蛋白表达持续升高,在造模第7天蛋白含量的表达达到最强;与相同时间点的正常组比较,具有显著性差异(P<0.01)。在各个时间点,全药组NF-k Bp65蛋白表达均高于正常组,具有显著性差异(P<0.05)。与同时间点的模型组比较,均具有显著的差异性(P<0.05)。君臣组在不同时间点NF-k Bp65蛋白表达均低于模型组,且高于正常组,均具有显著性差异(P<0.05);与全药组比较,在第7天蛋白表达具有显著的差异性(P<0.05)。9.各组大鼠肺组织中TLR4 m RNA不同时点的表达水平正常组可以检测到少量TLR4 m RNA表达,各时间点比较均无显著性差异(P>0.05)。不同时点的模型组大鼠TLR4 m RNA的表达明显高于正常组,具有显著性差异(P<0.05);其中第7天达到最强,且随着病程的进展表达逐渐增强;全药组相比于模型组,不同时点的TLR4 m RNA表达水平均明显低下(P<0.05),但高于正常组;君臣组与模型组相比,第7天有显著差异(P<0.05),全药组与君臣组相比,第7天有显著性差异(P<0.05)。10.各组大鼠肺组织中NF-κB P65 m RNA不同时点的表达水平正常组可以检测出少量NF-κB P65 m RNA表达水平,各时间点比较均无显著性差异(P>0.05)。不同时点的模型组大鼠NF-κB P65 m RNA的表达明显高于正常组,具有显著性差异(P<0.05);其中第7天达到最强,且随着病程的进展表达逐渐增强;全药组相比于同时间点的模型组NF-κB P65 m RNA表达水平低,有显著性差异(P<0.05);与正常组比较,均高于正常组有显著性差异(P>0.05)。君臣组的NF-κB P65蛋白表达与同时间点的模型组比较均低,第7天具显著性差异(P<0.05);不同时点的蛋白表达均高于正常组(P<0.05~0.01);与全药组相比,第7天蛋白表达有显著性差异(P<0.05)。结论:1.RSV诱导大鼠肺炎的发病机制可能与TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化有关,进而导致通路下游TNF-a,IL-6等炎症细胞因子的异常分泌,从而成为造成大鼠肺脏免疫病理损伤严重的机制之一。2.外敷清肺通络膏能明显减轻RSV感染大鼠的肺部炎症,其对RSV肺炎大鼠的防治作用与抑制RSV感染大鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化有关。3.外敷清肺通络膏的全药组与君臣药组在不同时点均能不同程度阻断RSV感染肺炎大鼠肺组织中TLR4和NF-κB P65蛋白的高表达、抑制TLR4和NF-κB P65 m RNA的高表达,能够显著下调RSV感染TLR4介导的信号通路下游TNF-a,IL-6等炎症细胞因子的表达。4.清肺通络膏干预RSV诱导大鼠肺炎全药组在病变过程中各时点对TLR4和NF-κB P65高表达的抑制作用强于君臣药,说明全药比君臣药效果更好,可能与用药剂量和外用贴膏中介质的作用有关。