论文部分内容阅读
目的:DNA损伤的产生及其修复的抑制是判断放疗疗效的关键。然而目前几乎所有的改进放射治疗的策略都只关注其中一个方面,而忽略了它们结合的必要性。本研究将构建一种DNA双靶向纳米药物,以同时增强DNA损伤的形成,并防止后续的修复,显著增强放疗效果。此外,该纳米平台还可以通过荧光和磁共振成像技术,实现药物精确递送和实时成像引导的精准放疗。总之,本研究的成像引导的DNA双靶向设计为有效的癌症精确放疗提供了新策略。方法:1.构建包载顺铂前药(PtIV)和或伏立诺他（vorinostat）的HIV-1转录反式激活蛋白（TAT）和或2,3-二甲基马来酸酐（DA）修饰的聚乙二醇-b-聚乳酸共聚物（PEG-b-PLGA）纳米药物(NP、NP/Pt、NP/Vor、NP/Pt+Vor和DANP/Pt+Vor),并对其进行表征,包括粒径、表面电势、稳定性和药物释放。2.分别利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）、电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）和超微量分光光度计评估包载顺铂纳米颗粒在EMT-6细胞中的摄取情况和铂化DNA水平。3.分别用伏立诺他、NP/Vor、NP/Pt、DANP/Vor、DANP/Pt、NP/Pt+Vor和DANP/Pt+Vor作用于EMT-6细胞,通过细胞免疫荧光技术测量γ-H2AX评估放疗前后不同时间点DNA损伤情况。4.利用流式细胞仪分别检测载铂纳米颗粒对细胞凋亡的影响,以及载伏立诺他纳米颗粒对细胞周期和胞内ROS水平的影响。5.克隆形成实验用于评估不同载药纳米颗粒的放疗增敏效果。6.构建EMT-6动物模型,利用荧光成像和核磁共振成像技术评估纳米药物(NP/Pt+Vor和DANP/Pt+Vor)在体内脏器分布、肿瘤富集和药物代谢。7.通过肿瘤生长抑制实验,绘制肿瘤抑制曲线,评估该DNA双靶向纳米药物的治疗效果,并监测实验小鼠的精神状态和体重变化以评估药物的毒副作用。8.通过HE染色、TUNEL染色和Ki67染色进一步研究该DNA双靶向纳米药物的治疗效果。结果:1.成功构建相关纳米药物,其具有合适的粒径、良好的稳定性和缓慢可控的药物释放能力。2.LSCM和ICP-MS分别证明了DANP/Pt有更高的细胞摄取率和铂-DNA加合物形成率。流式细胞仪实验证明了随时间变化,DANP/Pt+Vor组相较于其他组均显著增加γ-H2AX的形成。不同形式的伏立诺他均显著提高细胞内ROS的水平。克隆形成实验显示DANP/Pt+Vor的放疗增敏比（SER）最高。3.荧光成像和核磁共振成像实验显示DANP/Pt+Vor具有更强的肿瘤内集聚和滞留能力,纳米药物在24-48小时内的肿瘤内积累最高。肿瘤生长抑制实验证明DANP/Pt+Vor联合放疗抗肿瘤效果最强,具有接近90.0%的肿瘤生长抑制功效。18天后处死小鼠,肿瘤组织HE染色表明在用DANP/Pt+Vor+RT组肿瘤细胞几乎全部凋亡或坏死,TUNEL染色和Ki67染色显示该组小鼠肿瘤组织的凋亡率最高而增殖率最低,进一步验证了其抗肿瘤效果。结论:成功开发出一种包载顺铂前药和伏立诺他DNA双靶向纳米药物。在体外水平证明其具有良好的细胞摄取、DNA损伤和放疗增敏效果。体内水平显示该纳米药物在血液循环和肿瘤富集上优势明显,实现了增强DNA损伤和抑制其修复的协同增效,显示出优异抗肿瘤效果。