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第一部分氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜结构的影响【目的】建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)模型,研究氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌成熟BF的结构影响。【方法】平板培养法培养铜绿假单胞菌7天,得到成熟BF,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察氨溴索对BF形态结构的影响;激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)结合BF图像结构分析软件(Image Structure Analyer,ISA)对BF结构参数分析;荧光显微镜定性观察氨溴索对BF内活菌的作用,并测定氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌的荧光强度。【结果】氨溴索作用后电镜观察可见BF被破坏,基质样物变稀疏,仅见少量散在细菌。ISA软件定量分析显示:氨溴索2mg/ml作用后,BF厚度、平均扩散距离(Average Diffusion Distance ,ADD)和结构熵(Textual Entropy ,TE)均分别由39.22±2.01 ,1.08±0.001和6.25±0.22减少到10.09±2.32,1.00±0.002和5.19±0.41 (p<0.05);区域孔率(areal porosity ,AP) 0.70±0.03增加0.91±0.02 (p<0.05)。0.75mg/ml氨溴索干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显:BF厚度,AP,ADD和TE变化为20.10±2.86 ,0.82±0.04,1.03±0.004和5.36±0.34 (p<0.05)。用荧光显微镜定性观察,当氨溴索浓度大于0.49mg/ml时,BF内活菌数减少。同时,氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1,p<0.05),且随着氨溴索浓度升高,协同作用增强。【结论】氨溴索可影响铜绿假单胞菌成熟BF形态结构,从而增强抗生素的杀菌活性。第二部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜藻酸盐作用的体外研究【目的】探讨氨溴索对铜绿假单胞菌临床分离株形成的BF主要成分藻酸盐的干预作用。研究其对藻酸盐合成过程中起重要作用的基因表达和合成过程中限速酶活性的影响,以及其对藻酸盐降解的影响。【方法】建立铜绿假单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7天后得到成熟BF。将BF内的细菌振荡下来后,用硫酸-苯酚法检测氨溴索对藻酸盐含量的影响;RT-PCR检测藻酸盐合成过程中重要基因algD,algU, algR,mucA的m RNA表达;分光光度计检测合成过程中限速酶—GDP-甘露糖脱氢酶(guanosine diphospho-D-mannose dehydrogenase,GMD)的活性,并检测藻酸盐的降解情况。【结果】生理盐水对照组与氨溴索3.75mg/ml作用组比较,藻酸盐含量(mg/g)由86.4024±0.8588下降到59.9199±0.5803(F= 66.2 ,p<0.01);其合成重要基因algD,algU, algR,mucA的m RNA的表达分别由1.2994±0.0173,1.0488±0.0457,0.9888±0.0267和0.8731±0.0336变化为1.0253±0.0265 ,0.9594±0.0106,0.8536±0.0179和1.0770±0.0503(F= 91.9 ,41.1,88.4和56.9,p均<0.05);其合成限速酶GMD活性由0.0989±0.0055下降到0.0558±0.0016(F=121.2 ,p<0.01);藻酸盐的降解量(△mg/g)由1.4122±0.0073变化为1.4175±0.0019(F=21.81, p>0.05)。1.875mg/ml氨溴索组有同样的趋势但效应不如高浓度明显。【结论】氨溴索可以降低铜绿假单胞菌BF藻酸盐的含量,影响藻酸盐合成过程中重要基因algD,algU, algR,mucA的m RNA的表达,降低藻酸盐合成限速酶GMD活性,但对藻酸盐的降解无影响。第三部分氨溴索对野生型铜绿假单胞菌在双氧水刺激下向粘液型转换的抑制作用【目的】探讨氨溴索对野生型铜绿假单胞菌在用双氧水刺激下向粘液型转换的抑制作用。【方法】分别用亚致死量双氧水及双氧水加氨溴索作用于野生型铜绿假单胞菌后,观察野生型铜绿假单胞菌形态的变化,基因测序法检测mucA基因的突变情况及硫酸-苯酚法检测藻酸盐含量的变化。【结果】在双氧水的持续刺激下,野生型铜绿假单胞菌变为粘液型,菌落形态由干燥规则变得湿润肥大,边界不规则;基因测序发现mucA基因出现了多个位点的错义突变,藻酸盐含量由不能检出变化为69.6226±0.7652mg/g。同时加入双氧水和氨溴索后,野生型铜绿假单胞菌的形态和mucA基因序列均未发生变化,藻酸盐含量仍不能检出。【结论】氨溴索可以对抗双氧水的作用,阻止野生型铜绿假单胞菌向粘液型铜绿假单胞菌转换。第四部分氨溴索对导管相关性粘液型铜绿假单胞菌生物膜感染的体内干预作用【目的】建立大鼠导管相关性粘液型铜绿假单胞菌生物膜感染模型,探讨氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜的体内干预作用及对生物膜引起的肺部感染的影响。【方法】建立铜绿假单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7天后得到成熟BF。将BF植入大鼠气管建立大鼠导管相关性粘液型铜绿假单胞菌生物膜感染模型,分为BF感染组,BF氨溴索干预组,空白导管对照组和正常对照组。分别在植入后第4天和第7天处死大鼠,取出导管通过扫描电镜观察导管上BF的结构改变,检测导管上藻酸盐的含量并进行菌落计数;观察肺部大体改变并评分,将部分肺组织进行HE染色观察病理改变,并检测肺组织匀浆和血浆中藻酸盐抗体,IFN-γ和IL-10的含量。【结果】成功建立大鼠导管相关性粘液型铜绿假单胞菌生物膜感染模型。在两个时间点BF感染氨溴索干预组大鼠气管导管上的BF结构被破坏,导管上BF内的细菌减少,在术后4天和7天BF感染氨溴索干预组和BF感染组菌落计数分别为8.3494±0.025 lgCFU VS 8.5669±0.11 lgCFU和8.1527±0.015 lgCFU VS 8.5009±0.013 lgCFU (F=87.6和F=507.5, p<0.05)。BF藻酸盐的含量也减少,术后4天和7天BF感染氨溴索干预组和BF感染组藻酸盐含量分别为55.3776±0.842mg/g VS 83.4886±0.0.538mg/g和42.3721±0.505 mg/g VS 74.6215±0.215mg/g(F=791.7和F=3450.9, p<0.05)。BF感染氨溴索干预组和BF感染组肺部大体改变及肺组织病理变化,肺部大体改变指数(lung index of macroscopic pathology,LIMP)积分在术后第4天分别为0.1857±0.018和0.1929±0.025 (F=2.0, p>0.05);在术后第7天前者较后者降低,分别为0.1928±0.024和0.2357±0.031(F=4.9,p<0.05)。肺部菌落计数显示BF感染氨溴索干预组和BF感染组在术后4天和7天分别为6.5049±0.0616 lgCFU VS 6.3216±0.11 lgCFU , (F=52.3, p<0.05)和6.1527±0.015 lgCFU VS 6.1729±0.013 lgCFU (F=1.1,p>0.05)。BF感染氨溴索干预组和BF感染组的血浆抗藻酸盐抗体含量在两个时间段分别为0.7721±0.006 VS 1.0005±0.006和0.7917±0.007 VS 1.0195±0.007 (F=351.9和844.5,p<0.05)。BF感染氨溴索干预组和BF感染组的IL-10水平在术后4天和7天分别为158.6069±2.009pg/ml VS 162.8088±2.166pg/ml和168.4113±0.007 pg/ml VS 171.2125±1.578 pg/ml, (F=2.1和1.7, p>0.05。BF感染氨溴索干预组和BF感染组的IFN-γ水平在在术后4天和7天分别为74.0397±2.311 pg/ml VS126.8600±4.026pg/ml和63.3759±1.516 pg/ml VS 174.3221±4.444 pg/ml(F=129.5和558.2, p<0.05)。BF感染氨溴索干预组和BF感染组的IFN-γ与IL-10比值在术后4天和7天分别为0.4937±0.011VS 0.8088±0.025和0.4566±0.012 VS 1.0264±0.019(F=121.9和731.1, p<0.05)。【结论】氨溴索可破坏大鼠气管导管上的BF结构被,减少导管上BF内的细菌和BF藻酸盐的含量。氨溴索在手术后第7天减轻肺部病理变化。氨溴索可降低抗藻酸盐抗体的表达,减轻肺部免疫损伤。氨溴索可降低IFN-水平和IFN-与IL-10的比值,减轻藻酸盐引起的炎症反应。