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一、研究意义与目的2018年全球发生180多万新的结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)病例和881,000例死亡病例,约癌症病例和死亡病例百分之110。总体而言,结直肠癌的发病率排名第三,但死亡率排名第二。由于文化和饮食习惯的变化,在大多数患有结直肠癌的患者中,在早期阶段是无症状的;结直肠癌患者死亡的主要原因是远处转移到其他器官,如肝脏、肺、脑和骨,预后非常的差。在过去十年中,我们对结肠癌特征的理解有了显着改善。尽管在诊断和治疗方面取得了很大进展,但结直肠癌(CRC)仍然是全世界的主要健康负担,特别是在具有西化生活方式和人口老龄化的发展中国家。因此,研究新的分子生物标记物(CRIP1)以便可以在早期阶段检测结肠直肠癌或者对结直肠癌的诊断和预后具有帮助。二、方法1.荧光定量RT-PCR和免疫印迹检测CRIPI在结直肠癌细胞系中mRNA水平及蛋白水平。2.免疫组织化学染色检测CRIP1在人结直肠癌及正常肠粘膜组织组织中表达情况,对比转移性结直肠癌组织和非转移性结直肠癌组织CRIP1表达情况。3.构建稳定过表达CRIP1的SW620和CRIP1十扰的HCT116结直肠癌细胞株,通过CCK-8和裸鼠体内成瘤实验验证CRIP1队结直肠癌细胞增殖的影响。4.对RKO细胞过表达CRIP1,对SW480和HCT116细胞干扰CRIP1表达,通过Transwell细胞迁移实验和划痕实验,验证CRIP1对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5.通过免疫印迹检测干扰CRIP1的SW480细胞验证了干扰CRIP1表达后,可抑制结直肠癌细胞EMT的发生。6.通过免疫共沉淀和蛋白质谱筛选出CRIP1的相互作用蛋白AKT1,并作出了 CRIP1通过和AKT1相互作用影响PI3K-AKT-mTOR信号通路介导结直肠癌的迁移和侵袭。三、结果1.荧光定量RT-PCR和蛋白免疫切迹结果显示CRIP1在结直肠癌细胞系中mRNA水平及蛋白水平表达各异。2.免疫组织化学染色结果显示,CRIP1在结直肠癌组织中高表达,而且表达越高,分期越晚。3.过表达CRIP1可促进SW620细胞增殖,干扰CRIP1可抑制HCT116细胞增殖;注射过表达CRIP1细胞的小鼠成瘤速度和体积明显高于对照组小鼠,注射干扰CRIP1细胞的小鼠成瘤速度和体积则低于对照组小鼠。4.划痕实验显示过表达CRIP1细胞的愈合速度明显快于细转染对照组细胞,shNC细胞的愈合速度明显快于shCRIP1细胞;Transwell实验结果表明过表达CRIP1表达后,结直肠癌细胞的侵袭能力明显增强,干扰CRIP1表达后,结直肠癌细胞的侵袭能力明显减弱。显微镜下观察到干扰CRIP1的SW480细胞对比shNC细胞表面侵袭性伪足减少。5.通过蛋白免疫印迹检测到CRIP1可以影响EMT相关蛋白的表达。6.通过免疫共沉淀和蛋白质谱选出CRIP1的相互作用蛋白AKT,验证了CRIP1能影响AKT的磷酸化从而激活PI3K-AKT-mTOR信号通路。四、结论1.CRIP1在结直肠癌细胞系中mRNA水平及蛋白水平均有所表达,并表达各异。2.免疫组化染色结果显示CRIP1在结直肠癌组织中高表达,并且其高表达可能与结直肠癌转移相关。3.过表达CRIP1可使结直肠癌细胞的增殖能力加强。4.过表达CRIP1表达后,结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力明显增强。5.干扰CRIP1表达后,可抑制结直肠癌细胞EMT的发生。6.CRIP1和AKT相互作用,从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进结直肠癌的增殖、迁移和侵袭。