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3型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus 3,DHAV-3）是引起雏鸭病毒性肝炎的重要病原之一,能够导致感染雏鸭的急性死亡。围绕解析DHAV-3致弱分子基础的科学问题,本文开展系列研究,结果如下:1.DHAV-3强毒株分离鉴定从鸭病毒性肝炎疑似病例分离到1株病毒,其VP1基因与中国多株DHAV-3的氨基酸相似性较高（95.7%～100%）;兔抗DHAV-3血清能够完全中和该毒株（血清效价≥1:160）,同时该分离株的兔抗血清对其他参考DHAV-3毒株具有较高的中和能力（血清效价≥1:200）;1日龄雏鸭接种该分离株后出现共济失调、角弓反张等典型症状,发病率100%（10/10）、死亡率80%（8/10）,死亡雏鸭肝脏明显出血、肿胀,表明该分离毒是一株具有良好的抗原性的DHAV-3强毒株。2.DHAV-3传代致弱及其免疫保护效果将DHAV-3分离株在9日龄鸭胚上连续传代至第120代,选择不同（CH-P10、CH-P30、CH-P60、CH-P90和CH-P120株）5株检测结果表明:（1）DHAV-3在鸭胚增殖能力增强,5代毒株的鸭胚尿囊液病毒含量分别为104.33ELD50/0.2m L、106.55ELD50/0.2m L、107.91ELD50/0.2m L、108.37ELD50/0.2m L和108.37ELD50/0.2m L。（2）CH-P10株能够引起全部雏鸭发病,80%（8/10）死亡;CH-P30株能致80%（8/10）雏鸭发发病\60%（6/10）死亡;CH-P60株、CH-P90株和CH-P120株对雏鸭的毒力明显降低,感染雏鸭无任何临床症状,雏鸭接种后可获得良好的免疫保护。3.不同代次DHAV-3全基因组比较分析对不同代次DHAV-3全基因组测序表明:CH-P10株连续传代至CH-P120株,其基因组没有出现缺失或插入现象,但有7个核苷酸位点发生稳定突变（C62T、T453C、T1142A、C4334A、G5215A、G6268A和A7181C）,其中2个核苷酸突变位于5’UTR区域（C62T和T453C）、2个核苷酸突变为无义突变（G5215A和G6268A）、3个核苷酸突变（T1142A、C4334A和A7181C）引起了相应氨基酸位点发生了突变。核苷酸突变T1142A导致VP0蛋白的第164位酪氨酸（Tyr）突变为天冬酰胺（Asn）;核苷酸突变C4334A导致2C蛋白的第71位亮氨酸（Leu）突变为异亮氨酸（Ile）;核苷酸突变A7181C导致3D蛋白的第378位基因编码蛋白的第71位异亮氨酸（Ile）突变为亮氨酸（Leu）。在CH-P10株（强毒）和CH-P60株（弱毒）之间仅存在VP0蛋白Y164N突变和2C蛋白L71I突变,推测这2个位点突变与DHAV-3毒力有关联性。4.DHAV-3感染性克隆构建用PCR和融合PCR将CH-P10亲本株分为大小相近的三个片段进行PCR扩增,第一个片段与第三个片段分别与第二个片段含有74个和83个碱基对的重叠区域。用融合PCR方法在第二个片段的2A基因中引入了一个同义碱基突变,使得反向遗传株病毒的第3403位核苷酸的G突变为T（作为感染性克隆的遗传分子标记）;在第一个片段的5’端添加p CMV,在第三个片段的3’端添加HDVR-SV40p A,加上含有人工标记遗传位点的第二个片段,即构成DHAV-3感染性亚基因组扩增子;将其转染DEF细胞,收集出现病变的DEF细胞培养物并接种9日龄鸭胚,对死亡鸭胚的尿囊液进行遗传标记的鉴定,结果表明成功构建了DHAV-3感染性克隆株（ISA-P10株）。检测结果表明:CH-P10株与ISA-P10株感染1日龄雏鸭的发病率和死亡率均分别为100%（10/10）和80%（8/10）（表明毒力相似）、接种9日龄鸭胚的ELD50分别为10-4.33/0.2m L和10-4.50/0.2m L（表明毒价相似）、均能够被DHAV-3抗血清中和（表明抗原稳定）;将ISA-P10株在9日龄鸭胚传10代并进行全基因组序列测定和分析结果显示具有良好的遗传稳定性。以上这些结果表明我们成功建立了DHAV-3反向遗传学操作平台。5.强毒致弱机制的分子基础利用DHAV-3反向遗传学平台对CH-P10株进行定点突变,成功拯救了含有VP0基因T1142A单点突变株（ISA-T1142A株）、2C基因C4334A单点突变株（ISA-C4334A株）及双点突变株（ISA-T1142A-C4334A株）。检测结果表明:ISA-T1142A株和ISA-C4334A株感染1日龄雏鸭的发病率和死亡率均分别为50%（5/10）和30%（3/10）,毒力均比亲本CH-P10株降低;ISA-T1142A株和ISA-C4334A株接种9日龄鸭胚的ELD50分别10-7.55/0.2m L和10-6.55/0.2m L（表明毒价较CH-P10株升高）。双点突变ISA-T1142A-C4334A株毒株感染1日龄雏鸭没有致病性,与CH-P60株相似。综上,应用感染性亚基因组扩增子技术构建了DHAV-3感染性克隆,成功建立反向DHAV-3遗传学操作平台。DHAV-3基因组的VP0基因T1142A（Y164N）与2C基因C4334A（L71I）突变均可以影响病毒对雏鸭的致病力,并且两个突变共同作用可以导致该毒株对雏鸭致病力的显著降低,是DHAV-3强毒致弱的分子基础。