一、前言跟腱是小腿腓肠肌内外侧头和比目鱼肌肌腱于足跟上方约15cm处融合而成,是人体中最粗大的肌腱,其上半部分为圆形,下半部分为扁平状,质地坚韧,色泽光亮呈白色。跟腱内纤维束为90。螺旋交叉排列,其独特的结构有助于跟腱的延长和在运动过程中能量的吸收和缓冲。跟腱不同于其他肌腱组织,其无明显的腱鞘,仅由两层腱膜组织包裹,并且血供相对较差,在跟腱的止点位置尤甚。跟腱主要功能是传递小腿三头肌的足跖屈力量,跟腱的正常功能对维持人正常站立及行走运动发挥着极其重要的作用。伴随着人民生活水平的提高和全民健身意识的普及,跟腱损伤及病变成为了临床工作中的多发常见病,跟腱病变常常导致严重的足踝部疼痛和活动受限,并伴有跟腱内影像学的异常改变。跟腱病变不仅在从事高强度体能训练的专业运动员人群中有较高的发病率,而且在运动强度适度的普通人群中仍具有一定发病率。合并临床症状的跟腱病变一旦发生,常常会对患者的运动功能造成极其不利的影响,常需要较长的恢复时间,更严重的是跟腱病变往往导致跟腱生物力学的性能的改变,如跟腱抗拉伸及抗疲劳能力下降等,使得跟腱无法满足并适应高负荷的运动需要。在从事剧烈运动负荷时,最终导致跟腱的断裂和足跖屈功能的完全丢失。而上述结果对于专业运动员的职业运动生涯通常是严重的打击。因跟腱断裂而中断职业生涯的运动员屡见不鲜,因此跟腱病变发病机制及其防治措施是目前运动医学研究领域的热点问题。但目前对于跟腱病的潜在病理变化过程及其病理生理机制尚不清楚,因此使其治疗的发展受到了严重制约。在既往的认识中,由于跟腱病变常伴有跟腱局部肿胀和疼痛,且甾体类抗炎药物可在一定程度上缓解跟腱病的临床症状,故将其发病的原因归结于原发性炎症的介导,因此跟腱病通常通称为“跟腱炎”(Achilles Tendinitis)。而伴随着学术界对于跟腱病变的病理学和病理生理学认识的更新,对“跟腱炎”这种传统的理论提出了很大的挑战。Jozsa和Kannus在1997年首先提出了“跟腱退变病”(Achilles Tendinosis)的概念,用以描述由于各种原因所导致的跟腱内部组织的缺氧、黏液样变、脂肪变、透明样变、纤维样变及钙化等多种退行性改变的过程。跟腱退变病的基本组织病理学特点是：1、跟腱内细胞增殖活跃,细胞数目增加；2、细胞基质成分合成增加；3、跟腱内胶原组织排列紊乱,丧失其正常结构；4、跟腱内有较多新生血管长入,跟腱呈富血管化。发生退变的跟腱大体组织较正常跟腱失去光泽度,呈灰白色,可形成厚薄不均水肿带和或局部硬结。其于既往“跟腱炎”概念的最大区别就是跟腱退变过程并不能简单认为是一个由前列腺素E2介导的原发性炎症反应过程,而是一个细胞外基质胶原纤维在反复微小应力刺激作用下,自我修复合成紊乱而最终导致退变失用的复杂过程。跟腱退变并不是一个代谢迟滞的过程,在其退变过程中细胞增殖的活跃程度,胶原基质合成代谢的转变等都说明其是一个代谢相对活跃的组织反应。上述观点在既往很多跟腱病的组织活检和生化及分子生物学检测的结果中得以明确的证实。退变跟腱在超负荷或正常应力刺激下,往往会进入失代偿的恶性循环,最终导致跟腱无法承受运动过程中突然增加的应力载荷,而发生断裂。有研究证明断裂的跟腱组织发生退变的程度常常较严重,但是跟腱退变常可能是隐匿发病的,大部分跟腱断裂的患者在发病之前可能并没有明显的跟腱病变的临床症状,其发病的隐匿性常常使得人们更容易忽视其危害性,因此更需要谨慎对待跟腱退变病的自然史,更加详细了解跟腱退变病的发病机制,才能规避跟腱退变病发病的风险因素,制定合理可行的防治策略来指导跟腱退变病的临床治疗。尽管在过去的20年中,对于跟腱退变病的病理过程有了更进一步的认识,但是其病因学及具体发病机制仍然没有被完全阐明。主要原因是缺乏有效的实验动物模型进行跟腱退变病的发病机制和治疗策略等方面的研究。构建有效的跟腱退变病动物模型并用以模拟人类跟腱退变的发生发展,是解决跟腱退变病防治难题的有效途径之一。在既往研究中成功诱导出若干跟腱退变的模型,可以模拟跟腱退变的病理变化和发病诱因,但既往模型均有其各自的优缺点,部分模型存在诸如操作程序复杂,操作设备条件要求较高,模型混杂因素较多等缺点,因而阻碍了动物模型的可重复性和推广应用,限制了跟腱退变病发病机制和防治措施的深入研究。因此有必要构建一种操作简单、可重复性强的新型跟腱退变病的动物模型,借以更好的研究跟腱退变性疾病防治的相关体内研究。钙化型跟腱退变病是跟腱退变病的一种特殊类型,其特点是跟腱退变伴发跟腱周围的钙化或者骨化,常严重影响跟腱的正常功能,意味着跟腱断裂的潜在风险升高,恢复周期漫长。跟腱内骨化形成可以增加跟腱的刚度,从而代偿跟腱受损所导致的生物力学强度下降。因此从宏观角度上看,跟腱内的骨化可以是做一种病理性的修复过程。尽管其病理机制尚不清楚,多数研究者倾向于接受“软骨内成骨”的理论,有一点值得肯定的是跟腱内的软骨细胞转化或分化在其发病过程中扮演着重要的角色。任何可能影响到软骨细胞转化或分化的因素都可能会改变跟腱内骨化的病理过程。从另外一个角度上看,跟腱内骨化形成可视为“异位骨化”,即正常情况下没有骨组织的软组织内形成的新生骨。任何对异位骨化具有预防和治疗作用的手段都可能对其产生一定疗效。瘦素(leptin)是一种大小约为16 kDa的非糖基化肽,由肥胖基因(ob)编码,主要由白色脂肪细胞分泌产生进入循环系统,作为一种内分泌调节因子,与糖尿病(db)基因编码的瘦素受体(leptin receptor)结合后,进而介导细胞内信号的传递,发挥细胞内参与调节能量代谢和细胞功能。自其1994年被发现后,即迅速被引入了各领域的研究中。目前有若干研究表明瘦素对软骨内成骨和软骨细胞分化成熟的促进作用,但其是否参与钙化型跟腱病的发病,目前国内外尚无关于此内容报道,值得进一步系统研究。环氧合酶-2(COX)是前列腺素E2合成过程中所必需的关键限速酶,参与调控炎症反应和细胞代谢。已有大量研究表明COX-2在异位骨化的发生过程中扮演重要角色,以COX-2为靶抑制软骨内成骨的骨化过程,可能发挥预防或抑制异位骨化发生的作用。假使将钙化型跟腱退变病视为一种特殊类型的异位骨化,COX-2是否在其发病过程中扮演重要角色,选择性抑制COX-2是否会对钙化型跟腱退变病具有一定预防作用呢?都是值得进一步探讨的问题。目前有研究结果提示瘦素可能通过上调COX-2的活性参与炎症介导的相关病理过程。那么在钙化型跟腱退变病的发病过程中,瘦素是否通过COX-2依赖的信号途径发挥作用,COX-2活性的改变是否会对瘦素一瘦素受体平衡产生影响,是需要进一步阐明的问题。二、目的本研究立足于跟腱退变病的研究现状,为进一步的认识跟腱退变病的发病机制,探索钙化性跟腱退变病的预防和治疗手段,本研究开展了如下四个方面的研究：1、构建并验证一种以超负荷应力为诱因的新型钙化型跟腱退变病动物模型。2、借助新型动物模型,直接在动物水平进行系统研究瘦素在钙化型跟腱退变病发病中的作用。3、探索塞来昔布对于跟腱内异位骨化发生是否具有预防作用,以及塞来昔布发挥抑制作用的关键时相和剂量。4、在体外试验中,探索在钙化型跟腱退变病的发病过程中,瘦素是否通过COX-2依赖的信号途径发挥作用,COX-2活性改变是否会对瘦素一瘦素受体平衡产生影响。三、材料和方法1、新型跟腱退变病的动物模型的构建选取80只SPF级6周龄C57/B6品系小鼠,雌雄各半,随机分为实验组和对照组,实验组麻醉后于无菌操作条件下行左侧跟腱切断术,对照组进行皮肤切开缝合术。术后于标准环境下饲养。术后12周处死动物,取动物右侧膝关节以下组织,分别对右侧跟腱进行H&E染色,甲苯胺兰染色、免疫组织化学染色,免疫荧光化学染色等组织学评价；使用X光平片和Micro-CT扫描进行影像学评价；利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察跟腱内结构变化；同时评价其生物力学性能改变。在动物水平和组织学水平验证小鼠跟腱退变病模型的成功构建。2、瘦素在钙化型跟腱退变病发病过程中的作用研究选取40只SPF级6周龄db/db小鼠和40只6周龄的C57/B6品系野生型小鼠,雌雄各半,db/db小鼠设为实验组,C57/B6品系野生型小鼠设为对照组,两组均在麻醉后于无菌操作条件下行左侧跟腱切断术。术后于标准环境下饲养。术后12周处死动物,取动物右侧膝关节以下组织,分别对右侧跟腱进行H&E染色,番红O-快速绿染色、免疫组织化学等组织学评价；使用X光平片和Micro-CT扫描进行影像学评价；以明确在瘦素受体突变的情况下,是否影响钙化型跟腱退变病的发病。3、环氧合酶2参与调控钙化型跟腱退变病发病的机制研究选取6周龄大小的SD大鼠80只,雌雄各半,于麻醉后于无菌操作条件下行左侧跟腱切断术,待麻醉苏醒后随机将大鼠分为等分为8组：1、10mg/kg/day Celecoxib喂饲12周组(Single dose group):术后第2天开始每天细针灌胃喂饲10mg/kg/day Celecoxib水溶液至术后12周。2、双倍剂量20mg/kg/day Celecoxib喂饲12周组(Double dose group):术后第2天开始每天细针灌胃喂饲20mg/kg/day Celecoxib水溶液至术后12周。3、10mg/kg/day Celecoxib喂饲3周组(3 weeks group):术后第2天开始每天细针灌胃喂饲10mg/kg/day Celecoxib水溶液至3周,术后3周后每日喂饲等量的0.9%生理盐水。4、10mg/kg/day Celecoxib喂饲6周组(6 weeks group):术后第2天开始每天细针灌胃喂饲10mg/kg/day Celecoxib水溶液至6周,术后6周后每日喂饲等量的0.9%生理盐水。5、10mg/kg/day术后3周起喂饲Celecoxib组(Post 9 weeks group):术后第2天开始每日喂饲等量0.9%生理盐水至术后3周,术后第3周开始每天细针灌胃喂饲10mg/kg/day Celecoxib水溶液至术后12周。6、术后6周起喂饲10mg/kg/day Celecoxib组(Post 6 weeks group):术后第2天开始每日喂饲等量0.9%生理盐水至术后6周,术后第6周开始每天细针灌胃喂饲10mg/kg/day Celecoxib水溶液至术后12周。7、全程未给药阳性对照组(Postivie control group):术后不做任何额外药物喂饲处理直至术后12周。8、全程生理盐水喂饲安慰剂对照组(Placebo group):术后第2天即开始每日细针灌胃喂饲等量0.9%生理盐水。所有动物均在术后12周处死,处死后即刻取大鼠双侧膝关节以下标本,分别对右侧跟腱进行H&E染色、免疫组织化学等组织学评价；使用X光平片和Micro-CT扫描进行影像学评价；以明确COX-2选择性抑制剂是否影响钙化型跟腱退变病的发病,以及其干预的合理剂量和干预时机选择。4、瘦素依赖COX-2途径参与钙化型跟腱退变病的发病机制体外实验研究体外分离培养原代大鼠跟腱细胞,选用分离培养好SD大鼠原代跟腱细胞接种于若干24孔板,设置A组将NS398加入对应孔的培养基中持续干预大鼠跟腱细胞,NS398终末浓度梯度分别为0.2uM,2uM,20uM。每个浓度设置3个复孔。设置B组将重组瘦素蛋白加入对应孔的培养基中持续干预大鼠跟腱细胞,瘦素终末浓度梯度分别为50ng/ml,250ng/ml。每个浓度设置3个复孔。设置C组使用NS398和瘦素联合处理大鼠跟腱细胞,NS398终浓度为20uM,瘦素重组蛋白终末浓度梯度分别为50ng/ml,250ng/ml。每个浓度设置3个复孔。培养7天后,提取细胞蛋白样本。使用蛋白免疫印迹法分别检测各组细胞中COX-2,瘦素和瘦素受体的表达,以明确瘦素是否通过COX-2依赖的信号途径发挥作用,COX-2活性的改变是否会对瘦素一瘦素受体平衡产生影响。四、结果1、新型跟腱退变病的动物模型的构建小鼠单侧跟腱切断12周,对侧跟腱出现严重水肿并失去正常跟腱光泽,双侧跟腱内出现质硬的乳白色结节状物。组织学检查显示对侧跟腱内有大量细胞浸润和新生血管长入。电子显微镜观察可见对侧跟腱内出现纤维排列紊乱和胶原融合。X光和Micro-CT检查发现对侧跟腱内异位骨化形成,同时多合并跟骨畸形的发生。免疫组织化学检测证实跟腱内出现了软骨内成骨和纤维软骨肥大增生,其骨化过程是一个肥大软骨细胞骨化成骨的过程。生物力学检测结果提示对侧跟腱的生物力学性能明显下降。2、瘦素在钙化型跟腱退变病发病过程中的作用研究X光和Micro-CT检查的结果证明db/db小鼠单侧跟腱切断后双侧跟腱均未出现骨化发生。H&E染色和番红O-快速绿染色结果显示对侧跟腱内出现明显的细胞浸润,胶原纤维排列失稳,具有少量的血管长入,腱周组织具有少量细胞浸润和大量脂肪空泡积聚,但无软骨样细胞或者软骨样结构出现。对侧跟腱免疫组织化学检测结果跟腱内COX-2的表达较野生型对照组明显减少。3、环氧合酶2参与调控钙化型跟腱退变病发病的机制研究术后喂饲塞来昔布12周可明显降低大鼠跟腱切断后异位骨化发生率。不同剂量的塞来昔布对于大鼠跟腱切断后异位骨化发生率的影响无明显差异。术后3周起和术后6周起喂饲塞来昔布不能明显降低大鼠跟腱切断后异位骨化发生率,两组之间并无统计学差异。术后喂饲塞来昔布3周后停药和术后喂饲塞莱昔布6周后停药亦不能明显降低大鼠跟腱切断异位骨化的发生率,两者之间无统计学差异。术后3周起喂饲塞来昔布较术后喂饲塞来昔布6周停药组,异位骨化发生率也无统计学差异。术后喂饲塞来昔布12周可明显降低大鼠跟腱切断后异位骨化组织的体积。两种不同剂量的塞来昔布对于异位骨化组织的体积无明显影响。术后喂饲塞来昔布3周组较阳性对照组,异位骨化组织体积无明显差异。术后喂饲塞来昔布6周停药组较术后喂饲塞来昔布3周停药组,跟腱内异位骨化组织体积明显要小。术后3周起喂饲塞来昔布组较术后6周起喂饲塞来昔布组,跟腱内异位骨化组织体积明显要小。术后3周起喂饲塞来昔布较术后喂饲塞来昔布6周停药组,跟腱内异位骨化组织体积明显减小。术后喂饲6周塞来昔布后停药组较6周后喂饲塞来昔布组,跟腱内异位骨化组织体积明显减小。H&E组织学染色结果示术后喂饲塞来昔布12周的两组中未发生异位骨化的个体跟腱组织内可见跟腱内纤维排列走形紊乱,有大量细胞浸润和血管生成,少见部分软骨样细胞或软骨岛样结构,未发现带有成熟骨髓腔的皮质骨结构。其余6组均发现跟腱内纤维排列紊乱,有大量细胞浸润,可见大量肥大软骨细胞和被软骨基质包绕软骨岛样结构,周围伴生大量血管结构,均可在跟腱内发现具有成熟骨髓腔的皮质骨样结构。术后喂饲塞来昔布6周停药组较术后喂饲塞来昔布3周停药组,跟腱内肥大软骨细胞数目明显要少。术后3周起喂饲塞来昔布组较术后6周起喂饲塞来昔布组,跟腱内肥大软骨细胞数目明显要少。术后3周起喂饲塞来昔布较术后喂饲塞来昔布6周停药组,肥大软骨细胞数目无明显差异。免疫组化结果示损伤跟腱内瘦素广泛表达。4、瘦素依赖COX-2途径参与钙化型跟腱退变病的发病机制体外实验研究不同浓度的NS398可均明显抑制跟腱细胞内COX-2的表达。其抑制效果按照NS398浓度梯度依次递增,其中以20uM浓度抑制效果最佳。不同浓度的NS398呈浓度依赖性的抑制跟腱细胞瘦素和瘦素受体表达。不同浓度的重组瘦素蛋白可均明显促进跟腱细胞内COX-2的表达,其促进效果按浓度梯度依次递增,其中以250ng/ml浓度效果最佳。不同浓度的重组瘦素蛋白呈浓度依赖性的促进细胞瘦素受体表达。使用20uM的NS398可以抑制重组瘦素蛋白所激活的COX-2蛋白的表达。同时重组瘦素蛋白联合NS398共同处理大鼠跟腱细胞相较于使用空白对照组,跟腱细胞中瘦素受体的表达量未见明显上调。五、结论1、通过单侧跟腱切断,诱导对侧跟腱自然发生退变,成功构建了基于小鼠的一种新型钙化型跟腱退变病模型,该模型简单实用,可重复性高,可以较好的模拟人类跟腱退变病发病过程中的超负荷应力这一主要诱因。该模型为研究钙化型跟腱退变病的潜在发病机制提供了有利研究工具。2、通过将瘦素受体突变的db/db小鼠作为研究载体,利用本研究第一部分所构建的新型动物模型,观察在瘦素受体表达突变的情况下该疾病模型表型的改变。首次直接证明在瘦素受体突变失用的条件下钙化型跟腱退变病模型不能发生骨化。瘦素是软骨内成骨发生过程中的必需因素,其对于钙化型跟腱退变病的发病具有重要意义。3、使用塞来昔布选择性抑制COX-2可以发挥抑制跟腱内异位骨化发生的作用。其抑制异位骨化发生的机制可能是抑制跟腱内干细胞的异常成软骨分化和软骨细胞的肥大成熟,从而阻抑了异位骨化的启动和进展。首次报道了COX-2在跟腱内异位骨化过程中扮演重要的角色,为COX-2选择性抑制剂未来应用于钙化型跟腱退变病的临床治疗提供有力的动物实验依据。4、体外大鼠跟腱细胞实验证实在钙化型跟腱退变病的发病过程中,瘦素可能通过激活诱导COX-2活性,促进跟腱细胞外基质降解和跟腱内软骨细胞化生。在此过程中跟腱细胞瘦素受体的表达上调,可能进一步放大瘦素细胞内信号传导。而阻断COX-2信号途径可能抑制瘦素对跟腱细胞的所产生生物学效应,同时在一定程度上减弱瘦素细胞内信号的转导。在跟腱退变病的发病过程中,瘦素-瘦素受体信号通路和COX-2信号途径具有较大的关联,瘦素依赖于COX-2的活性促进钙化型跟腱退变病的发病。