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多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一类异常浆细胞过度增殖导致的恶性血液系统疾病,其发病率和死亡率在血液恶性肿瘤中均位居第二。MM的发生发展与多个基因的异常高表达密切相关,其中突出的是转录因子Maf蛋白家族,可能是治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点。Maf蛋白是重要的碱性亮氨酸拉链转录因子,其主要成员包括c-Maf,MafA,MafB等等。分子和细胞遗传学研究认为MM细胞中存在c-Maf,MafA,MafB的染色体易位。此外,它们的表达和功能还受到多种蛋白质翻译后修饰的调节,例如泛素化修饰。泛素化修饰由泛素激活酶(Ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素结合酶(Ubiquitin conjugating enzyme,E2)、泛素连接酶(Ubiquitin1igase,E3)和去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB)共同调节。但是Maf蛋白的泛素化是如何进行的目前还不清楚。我们在前期的质谱学研究中发现,在c-Maf免疫共沉淀复合物中存在HERC4蛋白。HERC4是HERC(HECT domain and one or more RCC1-like domain)家族中一员,具有泛素连接酶的活性,但是其是否是Maf蛋白家族的泛素连接酶,以及如何调节Maf蛋白的泛素化及其分子机制尚不清楚。因此本研究论文主要对HERC4调控Maf蛋白的作用机制进行探讨。第一部分HERC4对c-Maf蛋白的调节作用目的:鉴定HERC4是否为c-Maf蛋白的E3泛素连接酶;研究HERC4对c-Maf蛋白的调节作用及其详细分子机制;探讨HERC4与多发性骨髓瘤的关系。方法:1.在前期采用亲和纯化偶联质谱学得到c-Maf蛋白潜在的E3泛素连接酶HERC4的基础上,通过免疫沉淀、免疫荧光等方法从内源性和外源性两方面进一步确认HERC4和c-Maf蛋白的相互作用。2.利用免疫沉淀和体外泛素化方法检测HERC4对c-Maf蛋白泛素化的作用。用Western blotting方法分析HERC4对c-Maf、MafA和MafB蛋白稳定性和半衰期的影响。3.利用免疫沉淀和Western blotting方法研究HERC4对c-Maf蛋白赖氨酸突变体稳定性和泛素化的影响。4.采用Western blotting和体外泛素化检测方法分析去泛素化酶USP5对HERC4介导c-Maf蛋白降解作用的影响。5.通过生物信息学方法从GEO数据库(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)搜索相关数据,检测HERC4的表达谱;收集相关细胞和肿瘤病人样本,验证这些样本中HERC4蛋白和RNA的表达水平。6.构建HERC4的慢病毒,侵染MM细胞后分析HERC4对MM细胞增殖的影响;构建MM细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,分析HERC4对小鼠MM肿瘤生长的影响。结果:1.根据LC/MS/MS和免疫沉淀结果,发现了 c-Maf蛋白相结合的E3泛素连接酶HERC4;免疫沉淀结果从内源性和外源性两方面证实HERC4和c-Maf蛋白相互结合;免疫荧光结果证实HERC4和c-Maf蛋白共定位在细胞核内。2.免疫沉淀和体外泛素化结果显示HERC4可以诱导c-Maf蛋白的多聚泛素化,随后通过蛋白酶体降解;但是对MafB没有降解作用,相反使MafA蛋白的稳定性增加。提示HERC4对Maf蛋白稳定性的影响具有一定的选择性。采用Ub突变体转染实验发现,HERC4诱导的c-Maf泛素化主要是K48类型多聚泛素化。3.突变体实验结果显示,HERC4不能促进c-Maf第85、297和345位赖氨酸突变体蛋白的降解;进一步免疫沉淀发现HERC4不能介导c-Maf第85和297位赖氨酸突变体蛋白的泛素化,提示K85和K297是HERC4介导c-Maf蛋白泛素化的主要赖氨酸位点。4.通过LC/MS/MS方法发现了 c-Maf蛋白的去泛素化酶USP5,免疫沉淀和体外泛素化结果显示USP5可以阻止HERC4诱导c-Maf蛋白的泛素化,并稳定c-Maf蛋白。5.生物信息学结果表明HERC4在MM细胞及病人样本中低表达,且在MM病人中,随着MM恶性程度的提高,HERC4的表达逐渐降低;收集肿瘤细胞和MM病人样本后检测发现,HERC4在MM细胞系和病人样本中低表达。6.使用慢病毒侵染MM细胞系RPMI-8226和MM1.S后,c-Maf蛋白的表达明显被抑制;同时MTT结果显示,随着病毒侵染时间的延长,MM细胞的增殖也得到明显抑制。更进一步,皮下移植瘤模型结果显示过表达HERC4可延缓小鼠模型中MM肿瘤的生长,下调细胞和组织中c-Maf和CCND2(CyclinD2)蛋白的表达。小结:本部分确证了 HERC4与c-Maf的相互作用,是c-Maf蛋白的E3泛素连接酶。HERC4可以介导c-Maf蛋白第85和297位赖氨酸位点的泛素化,从而使其通过蛋白酶体降解;在体内和体外证实了 HERC4在MM中低表达,过表达HERC4可抑制MM细胞的增殖和小鼠移植瘤模型中MM肿瘤的生长。本部分从而得出结论:HERC4在MM中表现为一个抑癌基因,能够抑制MM的生长、增殖和存活。诱导HERC4表达而介导c-Maf蛋白的泛素化和降解可能是MM治疗的策略之一。第二部分HERC4对MafA蛋白的调节作用目的:MafA同属于Maf蛋白家族,也可以发生包括泛素化在内的多种蛋白质翻译后修饰。第一部分已经发现泛素连接酶HERC4可以诱导c-Maf蛋白的多聚泛素化,并诱导其降解,但对MafA蛋白却有上调作用,其具体机制和功能尚不清楚。本部分将研究HERC4对MafA蛋白的调节作用及其详细分子机制。方法:1.通过Western blotting方法检测HERC4对MafA蛋白稳定性和半衰期的影响。2.免疫沉淀方法分析HERC4与MafA蛋白的相互结合作用;并通过构建HERC4的截短体质粒,免疫沉淀方法确认HERC4与MafA蛋白相结合的重要结构域。3.免疫沉淀和体外泛素化方法研究HERC4对MafA蛋白泛素化水平的影响。4.通过免疫沉淀方法检测泛素结合酶UBE2O对HERC4诱导MafA蛋白泛素化的影响;并采用截短体质粒构建方法,进一步确认UBE2O影响HERC4作用的重要结构域。5.已有研究表明GSK3β能介导MafA蛋白磷酸化并促进其泛素化,我们采用免疫沉淀方法检测GSK3β对HERC4诱导MafA蛋白泛素化的影响。6.用免疫沉淀方法分析HERC4对MafA蛋白磷酸化的影响;并研究GSK3β对HERC4磷酸化的作用。7.采用荧光素酶实验方法研究HERC4对MafA转录活性的影响。结果:1.HERC4上调内源性和外源性MafA蛋白表达,并呈剂量依赖性趋势;当使用放线菌酮(CHX)抑制MafA蛋白合成时,HERC4不影响其蛋白半衰期。2.免疫沉淀结果显示HERC4可以与MafA蛋白相互结合,但不能和MafB蛋白相互作用;通过构建HERC4的不同结构域的截短体和免疫沉淀方法发现,其中间结构域(376-728 aa)是其与MafA蛋白相互作用的重要结构域。3.免疫沉淀和体外泛素化方法发现HERC4可以促进MafA蛋白的泛素化,并且主要是K63类非降解型泛素化。采用Ub的突变质粒转染后发现,Ub突变后明显阻止了 MafA蛋白的泛素化。使用HERC4 siRNA敲除HERC4表达后,也明显抑制了其对MafA蛋白诱导泛素化作用。4.泛素结合酶 UBE2O 的 D2 结构域(Ubiquitin conjugating domain)可以和HERC4相互结合并阻止其介导的MafA蛋白泛素化,但是D1结构域(Coiled-coil domain)和HERC4不存在相互作用也不能抑制MafA蛋白泛素化。UBE2O可以和HERC4的HECT和4号结构域(376-728 aa)相互结合。5.GSK3β增强HERC4与MafA蛋白的相互作用,并加强HERC4诱导MafA蛋白的泛素化。HERC4可以抑制MafA蛋白的磷酸化,GSK3β促进了 HERC4的磷酸化。6.MafA和c-Maf可以明显增强MARE-luciferase的荧光素酶活性,而共转了HERC4基因后,MARE-luciferase荧光素酶活性明显降低;当同时转染HERC4和GSK3β后,荧光素酶活性下降更突出,提示HERC4减弱了 MafA的转录活性;GSK3β增强了 HERC4对MafA转录活性的降低作用。小结:本部分发现HERC4可以和MafA蛋白相互结合,促进MafA蛋白K63类型泛素化,抑制其磷酸化,从而抑制其转录活性;GSK3β可以增强HERC4的作用,而泛素结合酶UBE2O阻止了 HERC4对MafA蛋白的诱导泛素化作用。结论HERC4是HERC家族中的一员,具有E3泛素连接酶的活性,但其对Maf蛋白的调节作用及其作用机制还未见报道。本研究通过LC/MS/MS方法,免疫沉淀,免疫荧光,体外泛素化系统,生物信息学,体内小鼠肿瘤模型等技术方法鉴定并发现E3泛素连接酶HERC4可以促进c-Maf蛋白的K48类型多聚泛素化,从而通过蛋白酶体途径降解;同时我们也发现HERC4可以诱导MafA蛋白K63类型非降解型泛素化;HERC4抑制MafA蛋白的磷酸化,上调MafA蛋白的表达,但却抑制了 MafA的转录活性。而GSK3β和UBE2O分别增强和抑制HERC4对MafA蛋白的诱导泛素化作用。HERC4在多发性骨髓瘤细胞和病人样本中低表达,过表达HERC4可以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖和小鼠皮下移植瘤模型的肿瘤生长。本研究为进一步深入了解Maf蛋白的泛素化机制奠定了一定的基础。