目的 比较角膜脱细胞的两种新方法；探讨以脱细胞异种角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮的可行性；评价组织工程化角膜上皮组织作为板层角膜移植供体的可行性，观察脱细胞角膜基质的细胞化情况和种子细胞的存活情况。 方法 (1)采用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase-Triton-X-100方法对兔角膜进行脱细胞处理，Dispase-Triton-X-100法对猪角膜基质片进行脱细胞处理，并从大体形态、超微结构、微生物检测等方面观察脱细胞角膜基质的特性和脱细胞效果。(2) 采用组织块培养的方法原代培养雄兔角膜缘上皮干细胞，并接种在脱细胞猪角膜前弹力层/基质上，观察细胞的游出、贴壁、增殖、融合等生长状况，进行形态学、组织病理学观察，免疫组化检测角膜上皮细胞的特异性蛋白CK3。(3) 采用角膜囊袋内植入的方法，将脱细胞猪角膜基质植入活体兔角膜囊袋检测抗原性和生物相容性。分组：A组脱细胞角膜基质组，植片为脱细胞猪角膜基质；B组新鲜角膜基质组，植片为新鲜猪角膜基质；C组空白对照组，只制作囊袋。术后观察实验兔角膜混浊、水肿、新生血管等情况并作评分，计算免疫排斥反应指数(RI)，确定临床排斥反应发生情况；组织病理学观察实验兔角膜在不同时间点的组织结构变化和植片的细胞化情况；免疫组化检测CD4<+>、CD8<+>T淋巴细胞在术眼角膜中的浸润情况，在细胞水平观察排斥反应情况。(4)以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体，同种雌性为受体，作板层角膜移植，裂隙灯显微镜观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况并作评分，计算RI，确定临床排斥反应发生情况。组织病理学检测组织结构变化，免疫组化检测脱细胞猪角膜基质的细胞化情况和上皮细胞的特性，Y染色体性别决定基因PCR(SRY-PCR)检测组织工程化角膜上皮细胞存活情况。 结果 (1)两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似，灰白色半透明，水肿明显，质地柔软。组织病理学和超微形态学观察两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整，纤维间距较正常增大，横纹规则，直径基本相同；NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞及细胞碎片，而Dispase-Triton-X-100处理的角膜组织未见细胞碎片。Disoase-Triton-X-100处理的猪角膜基质片与同种方法处理的兔角膜基质相似。(2)兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层/基质上，24h角膜缘上皮干细胞开始游出，48h贴壁，3-4d融合呈片状，6-7d形成单细胞层，呈铺路石样。组织病理学观察可见2-3层上皮细胞紧密贴附于脱细胞猪角膜前弹力层/基质支架上。免疫组化检测角膜上皮细胞表达特异性角蛋白CK3。(3)猪角膜基质植入兔角膜囊袋后，角膜逐渐恢复透明，A组实验兔在13-49d角膜恢复透明，平均约27.2d；B组实验兔在13-35d角膜恢复透明，平均约19.3d；C组在3-8d角膜变透明，平均4.4d；1月时透明率A组80％、B组90％、C组100％。各实验兔临床观察期内排斥反应指数RI<6，未见免疫排斥反应发生。组织病理学检查，光镜下A组、B组、C组角膜上皮、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮5层结构完整，A组、B组中央部位明显厚于周边部，植片胶原纤维排列平行、规则，植片/植床紧密贴合，A组少许基质细胞长入脱细胞角膜基质边缘，B组植片内可见散在细胞，C组与正常角膜组织相似，未见层间切迹。各组免疫组化检测未见CD4<+>、CD8<+>T淋巴细胞浸润，细胞水平未见免疫排斥反应。(4)组织工程化角膜上皮组织板层移植术后3-4d上皮光滑，荧光素染色不着色；角膜于15-20d恢复透明。RI<6，未见排斥反应发生。组织病理学观察，术后15d可见角膜上皮、基质、后弹力层、内皮完整，上皮细胞约4-5层结构，基底部细胞呈柱状，向上移行为扁平状，少许基质细胞长入脱细胞角膜基质；术后1月可见角膜上皮约7-8层，细胞形态结构与正常角膜上皮层相同，植片/植床紧密融合，无明显分界线，胶原纤维排列规整，多量基质细胞长入脱细胞角膜基质，未见多形核细胞浸润。免疫组化可见上皮细胞CK3染色阳性，脱细胞猪角膜基质支架内细胞vimentin染色阳性，与植床角膜基质细胞染色相同。SRY-PCR扩增结果显示，组织工程化角膜板层上皮，雄性对照，术后1d、3d、7d、15d、30d扩增产物约250bp大小，雌性对照未见扩增产物。 结论 Dispase-Triton-X-100法是一种良好的角膜脱细胞方法，以脱细胞猪角膜前弹力层/基质为支架可在体外构建组织工程化兔角膜板层上皮组织；组织工程化角膜上皮组织可作为板层角膜移植的供体，、脱细胞猪角膜前弹力层/基质细胞化良好，SRY-PCR是一种良好的组织工程角膜种子细胞的示踪方法。