研究背景角膜移植是机体内移植成功率最高的器官移植之一,而移植后排斥反应是导致角膜移植失败的最主要原因。研究认为：角膜移植术后免疫排斥反应是一个多成分参与、极为复杂和精细调节的反应过程。移植后随着移植抗原的提呈,CD4+T细胞激活,促使Th1分化,分泌IL-2. IFN-y、TNF-a等细胞因子,因此所致的迟发型超敏反应在角膜移植中起主导作用。Kuffova等认为移植后的免疫反应早期表现为炎症反应。Holland等也观察到在角膜排斥的早期存在非特异性的炎症反应：T细胞和巨噬细胞聚集在切口和缝线的周围,角膜植片增厚。Holland强调排斥反应的细胞免疫反应不同于同基因移植术后的细胞免疫,术后早期切口和缝线周围的非特异性炎症是诱导供体内皮细胞损伤、新生血管生长的重要因素。在炎症性植床,供体来源地树突状细胞移行到宿主的颈部淋巴结激活宿主T细胞,通过直接途径诱发排斥反应。角膜移植急性排斥反应的病理变化具有两个主要特征：角膜基质层的炎性细胞浸润和新生血管。角膜基质以单核细胞浸润为主,尚可见浆细胞、淋巴细胞以及中性粒细胞等。炎症的后果,导致角膜作为免疫特赦区域的优势完全消失,排斥反应发生早且严重,免疫抑制剂也发挥不了调控作用。虽然排斥反应是由宿主机体通过抗原提呈细胞激活CD4+T细胞促使,但最新证据表明先天免疫系统在其中也起着重要作用。TLRs (Toll like receptors)被誉为连接先天性免疫与获得性免疫的桥梁,而Toll样受体2(TLR2)是目前已克隆人类TLRs家族中表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多的分子。它分布于抗原提呈细胞、炎症细胞、多种组织细胞以及肿瘤细胞等,在细菌、真菌、病毒及其他一些病原体感染中发挥先天性免疫作用,并通过细胞内的信号转导过程连接获得性免疫。目前为止,发现的TLRs信号转导通路至少有两条,根据接头蛋白的不同,可将其分为MyD88依赖性和非MyD88依赖性两条途径,TLR2主要以MyD88依赖性途径进行信号转导。有研究发现TLR2单克隆抗体可以通过阻断TLR2-Myd88-NF-KB和TLR2-Myd88-IRF3路径,减轻移植后急性排斥反应,延长心脏移植物的存活时间。另有学者认为,MyD88缺陷小鼠可诱导供体抗原特异性的肾移植免疫耐受,以此逃避急性和慢性排斥反应。研究发现联合应用抗CD40L抗体后,无论是MyD88缺陷的供体还是受体都可减少移植后炎症细胞的浸润。这些研究都说明：TLR2可能通过MyD88下传信号,参与了同种异体器官移植术后的免疫排斥反应。我们的前期研究也已证实：TLR2可能参与了大鼠角膜移植排斥反应,在同种异体移植组术后第9天检测到TLR2mRNA的表达特异性增高,与组织病理学结果相吻合,免疫荧光结果显示TLR2在角膜移植术后第9天表达特异性增高并伴细胞膜转移。为进一步证实该结论我们通过运用TLR2单克隆抗体阻断TLR2的表达,观察移植术后植片的存活情况,临床观察术后第9-15d植片的排斥情况并行HE染色观察,并于术后第9d行免疫组化和实时荧光定量PCR检测TLR2及其下游信号分子MyD88的表达及分布情况,以进一步证实TLR2及其下游信号分子MyD88在角膜移植术后排斥反应中的重要作用。对TLR2/MyD88信号通路的深入了解不仅有助于我们明确TLR2在角膜移植排斥反应中的作用及其分子基础,为临床防治角膜移植排斥提供理论基础,也有利于某些疾病如肿瘤、微生物感染、过敏和自身免疫性疾病等免疫反应机理的探索,为今后在相应疾病的治疗和疫苗研制等方面的研究提供新切入点,为临床治疗这些疾病开辟更为广阔的路径。第一部分TLR2单克隆抗体影响大鼠角膜移植术后植片存活情况的实验研究目的观察TLR2单克隆抗体对同种异体大鼠角膜移植术后植片的存活情况的影响。方法实验分为三组：正常对照组(N)、同种异体角膜移植组(A)和同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体给药组(mAb), A、mAb两个实验组大鼠分别行穿透性角膜移植术,同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组经球结膜下注射给予15ug的TLR2单克隆抗体,自手术当日起隔天给药,即术后第0、2、4、6、8d,共5次；同种异体移植组术后以同法予等量的生理盐水。术后每日裂隙灯下观察角膜的水肿、透明度、新生血管生长情况,并对植片进行排斥反应指数评分,由2人分别计数取平均值,记录各组大鼠角膜植片发生排斥反应的平均天数。分别于术后第9d、15d取各组大鼠眼球石蜡包埋行HE染色后电子显微镜下观察各层角膜组织的结构变化。结果术后各组角膜随时间的变化均表现出不同程度的水肿、混浊及新生血管生成,以同种异体角膜移植组为甚。同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组发生排斥反应的时间为(15.67±0.753)d,较同种异体角膜移植组(9.67±0.876)d明显延迟,且差异有统计学意义(p=0.001)。HE染色结果显示：正常角膜组织分5层,各层结构清晰,基质层胶原疏松、排列整齐,无炎性细胞浸润；第9d,同种异体角膜移植组角膜植片厚度增加,基质层结构紊乱,新生血管管腔散在分布,并伴有多量的炎性细胞浸润；TLR2单克隆抗体组角膜各层结构尚清晰,基质层中仅有少量炎性细胞浸润；第15d,同种异体角膜移植组角膜增厚明显,角膜全层结构不清晰,其间可见多量的新生血管管腔和大量的炎性细胞浸润。而在TLR2单克隆抗体组,角膜各层结构尚清晰,基质层中仅可见少量炎性细胞浸润。结论TLR2单克隆抗体能有效地延长大鼠同种异体角膜移植术后植片的存活时间,减轻移植术后炎症反应。第二部分TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用探讨目的探讨TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后免疫排斥反应中的作用。方法实验分为四组,包括正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组和同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体给药组,三个手术组大鼠均行穿透性角膜移植术,术后同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体给药组经球结膜下注射予15ug的TLR2单克隆抗体,自术后当日起隔天给药,即术后第0、2、4、6、8d,共5次；自体组与同种异体移植组以同法给予等量的生理盐水。术后每日裂隙灯下观察角膜的水肿、透明度和新生血管生长情况,并对植片进行排斥反应指数评分,由2人分别计数取平均值。术后第9d取各组大鼠眼球石蜡包埋后行HE及免疫组化染色,另取各组大鼠角膜组织行实时荧光定量PCR,检测角膜组织中TLR2mRNA、MyD88mRNA的表达情况。结果术后随时间变化各组角膜植片均表现出不同程度的肿胀、浑浊及新生血管生成,特别是在同种异体角膜移植组中。HE染色结果显示：正常角膜组织分5层,各层结构清晰,基质层胶原疏松、排列整齐,无炎性细胞浸润；第9d,自体组角膜各层结构清楚,仅基质层中见少量炎性细胞浸润,余未见明显异常；TLR2单克隆抗体组角膜各层结构尚清晰,基质层中仅有少量炎性细胞浸润。而在同种异体组,角膜植片各层结构明显增厚,基质层结构不清,其间可见新生血管管腔,伴多量的炎性细胞浸润。免疫组化检测结果显示：TLR2和MyD88分子在正常对照组、自体组及TLR2单克隆抗体组的角膜上皮中均有微量表达,而同种异体组角膜上皮、基质细胞中TLR2和MyD88分子的表达明显增多,尤以基质层明显。实时荧光定量PCR结果显示：在正常对照组(1.01±0.213,1.00±0.07)、自体移植组(3.40±1.007,2.42±0.479)、同种异体移植组(23.7±1.974,4.11±0.572)和TLR2单克隆抗体组(12.87±2.001,2.32±0.758)中都检测到TLR2mRNA和MyD88mRNA的表达；同种异体组TLR2mRNA、 MyD88 mRNA表达程度较正常对照组和自体组明显上升,而在TLR2单克隆抗体组(mAb组)中二者表达较异体组明显降低,且趋势一致;将各组TLR2mRNA、 MyD88mRNA的表达差异进行统计学分析,先进行方差齐性检验TLR2: p=0.081,方差齐；MyD88:p=0.145,方差齐。然后选用LSD法两两之间进行比较,MyD88RNA在三个手术干预组中的表达均较正常对照组显著升高(P=0.012,0.016,0.000),在TLR2单克隆抗体组中的表达也明显低于同种异体角膜移植组(P=0.003),TLR2mRNA除了在正常对照组与自体组之间无显著差异(P=0.098)外,正常对照组、TLR2单克隆抗体组及同种异体组之间的组间比较都有明显差异,且其表达趋势与MyD88基本一致。结论TLR2单克隆抗体抑制TLR2及其下游信号分子MyD88的表达；TLR2/MyD88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,影响了角膜植片的转归。