我国水稻土中胞外呼吸菌的分布、多样性及其与产甲烷菌的耦合机制

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胞外呼吸是指在厌氧或者兼性厌氧条件下,微生物在胞内氧化有机物产生的电子经质膜、周质空间、细胞外膜,最终传递给胞外的电子受体,并产生能量供微生物自身生长的过程。胞外呼吸菌是具有胞外呼吸功能的微生物。Geobacteraceae是胞外呼吸菌的优势菌群,经常作为模式菌株进行研究。但是关于我国稻田土壤中Geobacteraceae的分布和多样性,目前国内外还尚未报道。  稻田土壤是介于水生生态系统和旱地生态系统之间的一种人工湿地生态系统,也是甲烷产生的重要场所。甲烷的产生除了包括氢型产甲烷作用、乙酸裂解产甲烷,还包括电化学产甲烷。电化学产甲烷即胞外呼吸的微生物将代谢过程中产生的电子传递给产甲烷菌,产甲烷菌还原二氧化碳产生甲烷。在这个过程中导电材料可以通过影响电子的传递从而影响甲烷的产生。生物质炭由于可以固碳以及提高作物产量,经常被添加到稻田土壤中。但是生物质炭对稻田土壤甲烷释放的影响或者生物质炭对胞外呼吸微生物与产甲烷微生物之间种间电子传递的影响目前并不清楚。  因此本研究的主要内容包括:调查我国稻田土壤中Geobacteraceae的分布和多样性以及影响因子,同时借助微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells,MFCs)装置的构建,研究阳极呼吸菌的组成和多样性,同时逐步深入分析调控阳极呼吸菌分布的关键环境因子以及各环境因子对不同稻田土壤中阳极呼吸菌群落差异的贡献率。在此基础上研究不同类型生物质炭对稻田土壤中胞外呼吸微生物与产甲烷微生物之间电子互营的影响。论文的具体研究结果如下:  1)运用Geobacteraceae16S rRNA基因的特异性引物,采用Illumina HiSeq高通量测序和定量PCR技术测定了我国16种稻田土壤中Geobacteraceae的群落组成、多样性和丰度。并且利用了多种方法如:多元回归树分析(Multivariate Regression Tree,MRT),Mantel检验和VPA(Variance Partition Analysis,VPA)分析,研究Geobacteraceae群落组成与土壤理化性质和地理因子之间的关系。定量PCR的结果显示不同种类的稻田土壤中Geobacteraceae16S rRNA基因的拷贝数范围为(1.20±0.18)×108到(1.13±0.23)×109基因拷贝数/克土壤(干重),Illumina HiSeq高通量测序结果显示Geobacter是Geobacteraceae中主要的属。MRT分析结果显示土壤无定型铁(amorphous iron,aFe)对Geobacteraceae群落差异的解释率(22.46%)高于其他的土壤理化因子,比如pH(14.52%),NH4+-N(5.12%)和DOC(4.74%)。另外,地理距离差异越大,Geobacteraceae群落组成的相似性越低。通过VPA分析得出,地理距离对不同地区Geobacteraceae群落差异的解释率(5.1%)高于任一其他环境因子。实验结果表明Geobacteraceae的绝对和相对丰度在我国稻田土壤中呈不均匀分布,同时证明Geobacteraceae的群落组成与地理因子和稻田土壤的理化性质比如aFe,pH,Fe,DOC,C∶N和NO3--N显著相关。这些结果拓展了Geobacteraceae在陆地生态系统中分布的知识,证明了无定型铁和地理因子在影响稻田土壤Geobacteraceae群落组成上起着重要作用。  2)通过构建土壤微生物燃料电池(Soil Microbial Fuel Cells,SMFCs),利用Illumina HiSeq高通量测序测定SMFCs阳极碳毡上富集到的细菌群落组成。通过VPA分析土壤理化性质和地理距离对不同稻田土壤富集到的细菌群落差异的相对贡献率。闭路(外接电阻)SMFCs阳极碳毡上富集到的细菌群落组成与开路(未外接电阻)SMFCs阳极碳毡上富集到的细菌群落组成显著不同。所有的闭路SMFCs阳极碳毡上均显著富集到了Nitrospira和Anaerolineae。我国不同稻田土壤富集到的阳极细菌的群落组成相似性与系统发育相似性与地理距离呈现显著相关性。不同稻田土壤阳极微生物群落组成与地理距离呈现明显的距离衰减的关系。VPA分析显示稻田土壤理化性质比如pH和DOC等与地理距离均影响了阳极细菌群落组成。  3)研究不同类型生物质炭介导水稻土中胞外呼吸微生物与产甲烷微生物耦合作用。采用血清瓶进行厌氧富集培养实验,研究分别添加三种不同类型的生物质炭:秸秆生物质炭(Rice straw biochar,RB),木屑生物质炭(Wood chips biochar,WB)和粪肥生物质炭(Manure biochar,MB)对甲烷产生过程的影响。与对照不添加生物质炭(Non-biochar,NB)比较,添加RB和MB处理甲烷产生速率分别提高了9.7倍和11.3倍,但是添加WB对甲烷产生并没有显著促进作用,这与三种生物质炭不同的电化学性质有关,比如C∶O和最大电容电流。Geobacteraceae16S rRNA基因和产甲烷菌的功能基因mcrA定量PCR结果显示,产甲烷菌比如Met hanobact erium和Met hanosarcina和Geobacteraceae存在着电子互营关系。RB和MB可以促进产甲烷菌和Geobacteraceae之间的电子互营从而提高甲烷的产生量。  以上研究结果表明,Geobacteraceae和潜在的胞外呼吸微生物(比如:Nitrospira)广泛分布于我国水稻土中,其分布和多样性与土壤的理化性质和地理距离有关。该研究对于将功能微生物的信息整合到当前生物地球化学模型从而预测元素的生物地球化学循环具有重要的意义。同时,不同生物质炭介导的稻田土壤中胞外呼吸微生物与产甲烷微生物之间电子互营的研究有助于更好地了解不同原材料制备的生物质炭对甲烷产生过程的影响,而且也为生物质炭对甲烷产生过程的影响机制提供了理论依据。
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