小叶杨(Populus simonii)是我国特有的杨属青杨派树种,广泛分布于我国北方地区,具有耐干旱,耐瘠薄,综合抗性强等特点,是构建我国三北防护林的主要树种之一,在黄河流域发挥着重要的生态和环境保护作用,具有较高的环境、生态和经济价值。但关于小叶杨的研究主要集中在遗传多样性评价以及利用其遗传优势进行传统杂交育种等有限的几个方面。由于杨树生长周期长,杂合度高等特点,阻碍了其自身的遗传改良进程。近年来,表观遗传已被越来越多的证据证明与植物生长抗逆等特性紧密相关,并且随着表观分子标记和重硫酸盐测序的迅猛发展,大大增强了表观遗传研究在林木辅助育种中的应用。本论文结合林木分子遗传国际前沿,将表观遗传学引入小叶杨遗传改良研究中。以来自9个种源地的小叶杨种质资源库505株不同基因型个体构成的自然群体实验材料,利用MSAP对小叶杨进行群体表观遗传研究。并挑选了抗逆优良无性系“QL9”进行重硫酸盐测序以期对其抗逆机制有更深入的解析,并结合SNPs完成表观基因型分型。同时,利用BP神经网络量化不同表观基因型对基因表达的影响。研究结果为杨树抗逆育种提供了理论指导与技术支持。主要获得以下结论:(1)利用MSAP技术检测小叶杨群体基因组甲基化水平,发现群体内存在广泛的甲基化变异,共获得20413个片段,其中8187个(40.11%)为多态性片段。利用香农指数对来自全国9省17地的小叶杨自然群体进行群体多样性评价,在对照组中,种群的多样性在0.654±0.551至1.248±0.397,其中陕西种群表观遗传多样性最为丰富,而甘肃种群多样性最低。9个亚群体之间的表观遗传多样性显著差异(χ2=42.179,P<0.001)。表观群体结构分析显示,小叶杨自然群体可分为三个亚群体。以黄河为界分为南北两部,又以太行山脉为界,将北部切割为东西两个亚群体,表明小叶杨传播的过程与地理环境紧密相关。来自不同种源地的小叶杨子群体保留了各自种源地的表观遗传信息,将其称之为“环境印记”,它们都是小叶杨在生境长期适应性生存积累的表观遗传信息。(2)小叶杨自然群体在干旱胁迫后,9个亚群体的多样性均显著下降,由甘肃省的0.115±0.287至陕西省的0.307±0.242,自然种群间差异并不显著(χ2=7.603,P=0.473)。并且小叶杨自然群体在干旱胁迫下表观群体结构由三个亚群变为一个群体。另外,对小叶杨种植地近60年气象资料的分析发现小叶杨自然群体自2007年移植山东冠县后,每年夏季都要遭受一次或数次干旱胁迫,表明小叶杨自然群体的表观遗传信息是随着外界环境的周期性刺激而响应的发生周期性变化。(3)DNA甲基化主要通过影响所修饰区域的基因表达来影响生物体的生长发育。首次提出了表观基因型用来描述等位基因上DNA甲基化的修饰状况,并引入线性回归来量化不同表观基因型对表达的影响作用,获得E=14.93X-17.19Y-19.57Z+22.12。指出不同表观基因型与基因表达之间的对应关系。但线性回归的应用范围较窄(R2=0.06),表明基因表达受到多重因素影响,是一个多维调控事件。随后作者引入了多维算法反向传播(BP)神经网络来构建一个潜在的模型。用SPSS 20进行主成分分析对输入数据进行筛选,纯合甲基化与杂合甲基化比值解释99.428%的比值方差,选择作为输入数据。通过对均方误差最小的均方误差分析确定隐含层为5,拟合成功率为99.059%,远高于6%的多元线性回归。此外,可以使用MATLAB训练好的BP神经网络对新数据进行预测,并且具有普适性,可以应用于其它处理甚至其它物种。之后,利用在干旱处理下训练的BP神经网络模型在对照组、高温、低温、高盐和渗透胁迫的表观基因型效应拟合成功率分别为43.32%,37.11%,39.41%,45.63%和50.78%。结果证明BP神经网络确实具有一定的普适性,可以应用于训练数据以外的其它数据。(4)DNA甲基化在响应外界环境刺激中扮演着重要角色。针对小叶杨实施了高温、低温、高盐与渗透四种胁迫,并进行了时序性监测,包括短期监测,处理后Oh,3h,6h,12h和24h;长期监测,处理后1个月,2个月和6个月。小叶杨在不同非生物胁迫处理后第一次检测就发现甲基化水平均出现了显著升高,表明外界刺激可以迅速地触发小叶杨基因组内DNA甲基化。其中高温处理下,甲基化水平升高最为显著,在3h和6h时间点明显高于其它处理。而在24h时,渗透和低温胁迫下DNA甲基化水平显著高于高温和高盐胁迫处理。表明在不同类型处理下,胞嘧啶甲基化有不同的应答模式。(5)在高温、低温、高盐与渗透胁迫等四种处理下,利用MSAP-sequencing技术体系,共分离并测序了 1376个胁迫特异性差异甲基化区域。去除测序失败和冗余片段后,共检测到1 123个映射编码蛋白质的基因,16个miRNA基因和17个lncRNA基因。其中胁迫特异性差异甲基化区域162同时映射到Psi-MIR396e和PsiLNCRNA00268512,该 lncRNA 可以作为 PsiMIR396e 的靶标 mimic 调节 miRNA水平。响应肋迫的甲基化水平随着时间逐渐衰退,在处理后一个月仅有约35.1%的响应胁迫的位点仍然保持甲基化,而在六个月后只剩约15.3%位点仍保持甲基化。在预测的那些miRNA基因中,在处理后六个月只有一个miRNA基因,即MIRNA6445a显示出甲基化的长期稳定性,仍然保留了甲基化修饰。以上结果揭示出小叶杨作为一种生长在野外的多年生高大乔木,为适应恶劣多变的生存环境,也许迅速、短期和灵活可逆的甲基化调节是一种更为有利的调控方式,而长期的甲基化标记也许来自于对生存环境的适应性积累,对其生存有着非常重要的作用。如:MIRNA6445a可以提高小叶杨对逆境的耐受性。