论文部分内容阅读
BMPs属于转化生长因子(TGF)-β超家族，具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成，促进骨折愈合，及具有控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。BMP6是BMP家族中发现较晚的成员，以软骨内和膜内成骨方式产生很强的骨诱导作用。BMP6的生物学作用不仅限于骨的生成，还参与心脏、肝脏、胰腺及小肠等多个器官的发育。由于BMPs在骨组织中含量甚微，通过基因重组技术制备rhBMP6(BMP6)可以满足基础研究与临床应用的需要。本实验室在前期工作中采用基因工程技术构建了表达rhBMP6的重组大肠杆菌细胞株E.coli BL21(DE3)/pET-15b-BMP6，重组蛋白在细胞质中以不溶的包涵体(IB)形式存在。本文主要对rhBMP6在大肠杆菌中诱导表达条件、纯化方法及包涵体溶解条件进行优化，经过复性，最终通过碱性磷酸酶活性(ALP)分析比较复性制备的rhBMP6与从R＆D公司购得的hBMP6标准品间的活性差异。主要研究内容及结果如下：
⑴优化条件为LB/Ampicillin(100μg/mL)，OD600nm l.400时加入1.0mmol/LIPTG，37℃诱导4小时，可获得表达量占菌体蛋白80％以上的rhBMP6。
⑵简化包涵体纯化步骤后rhBMP6纯度达到96％，含量为50mg rhBMP6/L LB。包涵体溶解条件确定为0.1mmol/L Tris-HCl(pH8.0)+0.25mol/L NaCl+0.4mol/LGdn-HCl，可得到10mg rhBMP6/L LB培养基。
⑶复性后rhBMP6经SDS-PAGE和Western blot检测二聚体占11.68％。通过对rhBMP6在大肠杆菌中诱导表达条件、纯化方法及包涵体溶解条件进行优化后，可得到纯度为96％，10mg rhBMP6/L LB。蛋白复性后碱性磷酸酶活性分析表明所制备的thBMP6活性大约为标准品的10-15％。