论文部分内容阅读
目的:骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,在不同诱导条件下能分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种组织细胞,是组织工程中理想的种子细胞。骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化受到Wnt信号通路等多种因素的调控。NDRG1被认为是一种肿瘤抑制因子,受到癌基因N-myc的调节。目前关于NDRG1调节骨髓间充质干细胞分化的作用尚无文献报道,本研究探讨NDRG1对骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的作用,并初步阐释其作用机制。方法:一、NDRG1对骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化的作用1.检测Ndrg1 mRNA的组织分布。运用qRT-PCR的方法检测在6周龄C57BL/6J小鼠不同组织中Ndrg1 mRNA的表达量,包括心、脾、肺、胃、脑、肾、结肠、小肠、骨、骨骼肌、胃肠脂肪、附睾脂肪、肾周脂肪和腹股沟脂肪组织。2.运用qRT-PCR的方法检测在小鼠骨髓间充质干细胞和骨髓基质细胞系ST2成脂及成骨诱导分化过程中的Ndrg1 mRNA表达量的变化。3.构建Ndrg1过表达载体。在ST2细胞中转染Ndrg1过表达载体及对照载体pcDNA3.1,进行成脂诱导分化,通过油红O染色观察ST2成脂分化的情况,qRT-PCR检测成脂分化相关转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增强结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)和标志基因脂肪细胞蛋白2(Adipocyte Protein 2,aP2)、adipsin的mRNA表达量,Western blotting检测PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白表达量;转染后诱导成骨分化,运用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色观察ST2细胞的成骨分化状态,qRT-PCR检测成骨分化相关转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Osterix和标志基因Alp、骨桥素(Osteopontin,Opn)的mRNA表达量,Western blotting检测Runx2、Osterix、ALP和OPN的蛋白表达量。4.设计合成Ndrg1的siRNA,将Ndrg1 siRNA及对照siRNA转染于ST2细胞中,抑制ST2细胞中Ndrg1的内源性表达并进行成脂及成骨诱导分化,运用油红O染色及ALP染色观察ST2细胞分化状态,运用qRT-PCR和Western blotting的方法检测抑制Ndrg1的内源性表达后对ST2细胞成脂及成骨分化的作用。5.构建Ndrg1敲低慢病毒,用Ndrg1敲低慢病毒及pLVX-shRNA2对照慢病毒感染小鼠BMSCs,进行成脂及成骨诱导分化,运用油红O染色、ALP染色和qRT-PCR方法检测Ndrg1敲低慢病毒对小鼠BMSCs成脂及成骨分化的作用。二、NDRG1对骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化作用的机制研究1.在ST2细胞中转染Ndrg1过表达载体,在未诱导情况下收取ST2细胞总蛋白,运用Western blotting的方法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白,β-连环蛋白(β-catenin)和低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Low density lipoprotein receptor related protein 6,LRP6)的蛋白量;转染后运用细胞免疫荧光染色的方法检测β-catenin蛋白的核转运情况;转染后收取ST2细胞的核蛋白,检测β-catenin及转录因子TCF7L2(Transcription factor 7-like 2,TCF7L2)在细胞核中的蛋白量。2.利用Ndrg1 siRNA抑制ST2细胞中Ndrg1的内源性表达,在未诱导情况下运用Western blotting检测β-catenin、LRP6和TCF7L2的蛋白量,细胞免疫荧光染色检测β-catenin蛋白的核转运情况。结果:一、NDRG1对骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化的作用1.Ndrg1在6周龄C57BL/6J小鼠的各个组织中均有表达,其中Ndrg1 mRNA在小肠中的表达水平最低,在脂肪组织中的表达水平中等,而在肾及骨组织中表达水平最高。2.在小鼠BMSCs的成脂或成骨诱导分化过程中Ndrg1的mRNA表达水平均呈先下调而后上调的趋势。另外,在小鼠ST2细胞的成脂诱导分化过程中,Ndrg1的mRNA表达水平呈先下调而后上调的趋势,而在成骨诱导分化过程中Ndrg1的mRNA表达水平持续上调。3.利用构建的Ndrg1过表达载体使ST2细胞内的Ndrg1表达上调,成脂诱导分化后,与对照组相比,过表达Ndrg1后ST2细胞向脂肪细胞分化增加,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表达水平上调,PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平上调;成骨诱导分化后,与对照组相比,ST2细胞的成骨分化能力减弱,Runx2、Osterix、Alp和Opn的mRNA及蛋白水平均下调。4.利用Ndrg1的siRNA抑制ST2细胞中Ndrg1的内源性表达,成脂诱导分化后,与对照组相比,抑制Ndrg1的内源性表达后ST2细胞向脂肪细胞分化减少,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表达水平下调,PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平下调;成骨诱导分化后,与对照组相比,ST2细胞的成骨分化能力增强,Runx2、Osterix、Alp和Opn的mRNA及蛋白水平均上调。5.利用Ndrg1的敲低慢病毒抑制小鼠BMSCs中Ndrg1的内源性表达,进行成脂诱导分化,与对照组相比,感染Ndrg1敲减慢病毒后BMSCs的成脂分化减少,PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的mRNA表达水平下调;成骨诱导分化后,BMSCs的成骨分化能力增强,Runx2、Osterix和成骨标志基因I型胶原(collagen type I alpha 1,Col1a1)的mRNA表达水平上调。二、NDRG1对骨髓间充质干细胞成脂及成骨分化作用的机制研究1.利用构建的Ndrg1过表达载体使ST2细胞内Ndrg1的表达上调,Western blotting结果显示在未诱导情况下,细胞内Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin,磷酸化LPR6(p-LRP6)的蛋白量减少;细胞免疫荧光实验表明β-catenin蛋白由细胞浆向细胞核的转移减少;Western blotting结果显示ST2细胞核中β-catenin的蛋白量减少,转录因子TCF7L2的蛋白量也减少。2.利用Ndrg1的siRNA抑制ST2细胞中Ndrg1的内源性表达,Western blotting结果显示在未诱导情况下,β-catenin和p-LRP6的蛋白量增加;细胞免疫荧光染色结果表明β-catenin蛋白由细胞浆向细胞核的转移增加;Western blotting结果显示细胞核中β-catenin的蛋白量增加,转录因子TCF7L2的蛋白量也增加。结论:1.NDRG1促进小鼠BMSCs和ST2细胞向脂肪细胞分化,而抑制其向成骨细胞分化。2.NDRG1通过Wnt/β-catenin信号通路调控骨髓间充质干细胞的成脂及成骨分化。