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第一部分:建立无精症患者诱导多能干细胞系目的:建立无精症患者诱导多能干细胞系,为进一步研究该疾病的发病机制和治疗提供合适的细胞模型。方法:利用仙台病毒非基因整合的方法,我们建立了无精症患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞系。采用无血清完全培养基(Te SR?2)和胚胎干细胞培养基(Stem Adhere?Defined Matrix)限定培养体系进行培养,应用免疫荧光染色、染色体核型分析、拟胚体和畸胎瘤实验对iPSCs系的干性、多能性、体内外分化能力进行验证。结果:我们建立了具有人胚胎干细胞特征的无精症患者来源的iPSCs系。免疫荧光染色显示,这些细胞均表达SOX2和OCT4以及TRA-1-60和SSEA-4干细胞多能性基因;染色体核型分析显示正常的核型;拟胚体和畸胎瘤实验表明其在体内、体外具有向三个胚层分化的能力。结论:利用非基因整合方法成功构建了无精症患者外周血来源的诱导多能干细胞系,为无精症发病机制的研究及治疗提供了细胞模型。第二部分:无精症患者iPSCs在体外分化成原始生殖样细胞的研究目的:将建立的无精症患者诱导多能干细胞(Patients with azoospermia induce pluripotent stem cells,pa-iPSCs)在体外定向诱导分化为原始生殖样细胞(primordial germ cell-like cells,PGCLCs)。方法:我们利用“4i”(PD0325901+CHIR99021+SB203580+SP600125)的培养体系将无精症患者来源iPSCs转化成naive iPSCs,然后将naive iPSCs在体外在含有b FGF、TGF-β1和1%KSR的预诱导培养基中培养2天,然后以2000-4000个细胞/孔传到低吸附的96孔板中,细胞培养在含BMP4、LIF、SCF、EGF、和ROCK inhibitor PGCLCs的分化培养基中。并用免疫荧光染色的方法对PGCLCs进行了特异标记鉴定。结果:我们成功将iPSCs转变成了na?ve态i PS细胞,然后在体外成功诱导出PGCLCs,免疫荧光染色显示PGCLCs表达PGC的特异标记OCT4,SOX17。结论:通过“4i”体系将pa-iPSCs转变成naive状态的干细胞,并将其在体外诱导分化成了PGCLCs,PGCLCs表达PGC的特异标记SOX17和OCT4,为体外人造精子治疗无精症患者提供了理论基础。