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Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显著地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显著降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显著降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显著影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显著降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。