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肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又名GDF-8(转化生长因子),首次于1997年美国约翰霍普金斯大学医学院Mcpherron科研小组在研究TGF-β(转化生长因子超家族)时采用简并PCR法在该家族的保守区域扩增得以发现。该基因作为骨骼肌特异性生长发育的负调控因子,遗传突变功能失活后能够产生肌肉急剧增加的“双肌表型”。本研究利用基因敲除技术体外构建针对绵羊Myostatin基因第三外显子缺失的基因敲除载体,转染入绵羊成纤维细胞,利用骨架载体上Neo基因替代Myostatin基因的exon3,以期达到使细胞内Myostatin基因失活的目的。对绵羊体细胞Myostatin基因敲除的可行性进行初步探索研究；为创制肉羊育种新材料、培育转基因绵羊奠定基础。本论文主要的研究结果如下:
(1)根据绵羊Myostatin基因全序列(GenBank No.DQ530260)利用LA-PCR技术,成功扩增得到绵羊Myostatin基因同源长臂4.9k,包括全部的exonl,intronl,exon2,及部分启动子和大部分intron2；同源短臂1.1K,包括部分exon3和3’非翻译区序列,将二者连入PloxpⅡ正负筛选基因敲除骨架载体,成功构建专门针对Myostatin第三外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpⅡ-OVIS-MSTN(13.5K),酶切和测序鉴定证明载体构建正确。
(2)通过组织块贴壁的方法建立绵羊耳缘组织成纤维细胞系,增殖活力良好,为后续细胞转染实验奠定基础。
(3)建立了绵羊Myostatin基因敲除载体转染及筛选方法:脂质体2.5ul,敲除载体2ug,转染效率较高；经过300ug／mlG418初步筛选7-10天,而后经200ug／mlG418加50nmol／1GANC维持筛选20天左右可得到明显的细胞克隆。
(4)经过30天左右的正负筛选共得到64个细胞克隆,经PCR鉴定后初步认为12号细胞克隆为发生了同源重组的阳性细胞克隆。
本研究根据Myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生“双肌”表型的特点,利用基因敲除技术使绵羊细胞内Myostatin基因缺失,从而为应用基因敲除及体细胞克隆技术相结合制作产肉率高的转基因肉羊建立技术研究平台,为肉羊育种及品种改良提供新思路。