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毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。该系统表达外源蛋白的最常用启动子为AOX1启动子,但是其高表达活性依赖甲醇作为单一碳源进行诱导,而受其他碳源的严格阻遏。甲醇对人体有毒的特性增加了将毕赤酵母表达系统应用于食品和药品生产的难度,易燃的特性增加了企业的安全防护成本,毕赤酵母代谢甲醇时的高耗氧和高产热使该系统在发酵放大过程中遇到不少困难。本实验室一直致力于开发基于非甲醇诱导的AOX1启动子的新型毕赤酵母表达系统,已获得了两株新型基因工程酵母菌株——突变株△mig1△mig2-Mit1能在甘油中实现AOX1启动子的脱阻遏;突变株△mig1△mig2△nrg1-Mit1分别能在葡萄糖和甘油中实现AOX1启动子的脱阻遏。本课题以这两株菌株为研究对象,在摇瓶培养和5 L生物反应器分批培养的方式,得到它们在葡萄糖及甘油中最大比生长速率的关系为WT>Amig1△mig2-Mit1 ≥ △mig1△mig2△nrg1-Mit1。在5 L生物反应器中,通过补料-分批方法培养突变株△mig1△mig2-Mit1和△mig1△mig2△nrg1-Mit1,均达到可以诱导表达外源蛋白的的菌体浓度,不影响以它们为宿主的表达系统的开发。然后,以这两个重组菌株为宿主表达人胰岛素前体,筛选得到一株在甘油中高效表达胰岛素前体的菌株△mig1△mig2△nrg1*-Mit1-IP(即 MF1-IP)。以MF1-IP菌株为研究对象,通过摇瓶培养发现,当葡萄糖浓度大于2%时,AOX1启动子的启动活性很低,通过补料-分批发酵的方法发现将发酵培养基中的葡萄糖浓度控制大于20 g/L,可以有效抑制AOX1启动子的活性。利用这些特性,以葡萄糖为生长碳源,甘油为诱导碳源,开发了一套与经典的毕赤酵母甲醇诱导三阶段发酵法相似的发酵工艺。该工艺对发酵诱导阶段的关键参数溶解氧、pH、诱导时的湿重及甘油补料速率进行了优化,并探索了脉冲式甘油补料诱导及葡萄糖-甘油交替补料诱导方法对MF1-IP生长及生产的影响。结果表明,最佳的甘油诱导胰岛素前体表达工艺为:溶解氧30%～50%、诱导pH 3.5、诱导时的湿重200 g/L、甘油持续补料速率为15.5 ml/(h·L broth)。MF1-IP在甘油中诱导表达胰岛素前体的发酵工艺与WT-IP在甲醇中诱导表达胰岛素前体的发酵工艺相比,发酵周期减少了 16 h,产量高达2.46 g/L,碳源转换的操作更简单,总耗氧和总产热均减少了 50%以上。通过计算OUR、kLa及恒化培养的方法,发现并证实了 MF1-IP在诱导后期传质效率下降的原因是后期过高的菌体浓度引起的发酵液高黏度,在此基础上用半连续补料的发酵方式降低了发酵液的黏度。另外,建立了以低浓度葡萄糖为诱导碳源的发酵工艺,发现该策略下补料速率越快,菌体生长速率越快,胰岛素前体生成速率也越快。诱导36 h达到产量的最大值,但产量只达到1.28 g/L,因此该策略较适合于需要快速得到少量产物的情况。利用恒化培养的方法发现MF1菌株在甲醇中的最大比生长速率远低于Mut+野生株,但是略高于Muts野生株,这与细胞的基因工程改造有关。在此基础上,采用控制葡萄糖浓度大于20 g/L的方法培养MF1-IP菌株达到适合的菌体浓度,考察了利用甲醇诱导表达胰岛素前体。MF1-IP菌株采用三种不同的甲醇补料速率诱导胰岛素前体表达时,产量均超越野生对照菌株WT-IP利用甲醇诱导胰岛素前体表达时的产量。当甲醇补料速率为较低的6.67 ml/(h·L broth)时,MF1-IP菌株的胰岛素前体表达量在发酵上清中达到6.69g/L,是对照菌株WT-IP(甲醇流速12ml/(h·L broth))的1.59倍;在发酵液中的产量达到3.55 g/L,是WT-IP的2.37倍;最大比生产速率达到了 3.8×104 g/(g·h),是WT-IP的1.7倍。计算氧消耗速率与产热率后发现,MF1-IP在诱导过程中的氧消耗速率和产热率也普遍比WT-IP低,最高氧消耗速率和产热率分别是WT-IP的82%和62%。碳源阻遏因子Mig1、Mig2、Nrg1的敲除和甲醇激活因子Mit1的过表达,对毕赤酵母在甲醇中的AOX1启动子表达能力有增强作用。