胞苷,即胞嘧啶核苷,可用作功能性食品及核营酸类保健食品的生产原料,也用于合成抗病毒和抗肿瘤药物的中间体及饲料添加剂,用途广泛,需求量逐年增加。微生物发酵法是工业生产胞苷的主要方法,高产菌株是其关键因素,已有枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与解淀粉芽孢杆菌发酵产胞苷的研究报道。但目前国内胞苷高产菌株的发酵能力有限,受到多种因素的影响,而菌株细胞自身合成代谢网络的优化是提高胞苷发酵产量必须要解决的问题。同时,为使解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢网络修饰更加快速高效,需建立方便易操作的基因敲除系统。论文主要从以下两个方面进行了研究。1、解淀粉芽孢杆菌胞苷合成代谢途径分析。(1)胞苷代谢网络整体分析。基于嘧啶生物合成代谢调控和胞苷代谢网络分析,提出了5种解淀粉芽孢杆菌胞苷生产菌育种策略,即提高嘧啶操纵子转录水平,强化胞苷合成代谢途径、增大磷酸戊糖途径向胞苷合成途径的分流量、提高胞苷合成前端代谢物PRPP的合成量、增强中心碳代谢流向胞苷合成途径和阻断胞苷降解途径等方法,选育胞苷高产菌株。(2)嘧啶操纵子在胞苷合成中的作用分析。确定首先改造解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子调控区域,研究其对胞苷合成的影响。操纵子调控区存在一个弱化调节蛋白PyrR,由pyrR基因编码。该调节蛋白通过作用于pyr操纵子非翻译区域的三段转录终止位点控制胞苷合成基因的表达与调控,但胞苷的过量合成与pyrR基因缺失影响尚不清楚。因此,可通过基因敲除技术,定向选育pyrR基因缺失菌株,研究其对解淀粉芽孢杆菌胞苷生物合成途径的调控机制。2、解淀粉芽孢杆菌高效基因敲除系统的构建。为实现解淀粉芽孢杆菌胞苷代谢网络的修饰改造,建立高效的基因敲除系统显得尤为重要。本研究构建了两个基因敲除载体系统,并对其敲除效率做了比较分析。(1)自杀型敲除载体pKS1-pyrR的构建。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用PCR分别扩增pyrR基因的上、游同源序列,定向克隆至含卡那霉素抗性基因的温敏型载体pKS1上,构建自杀型敲除载体pKS1-pyrR,酶切、PCR验证与测序分析均证明pKS1-pyrR载体构建正确。将pKS1-pyrR载体转化宿主细胞,通过同源重组将靶基因替换。结果表明,该方法重组敲除效率较低、且有抗性基因片段残留,增加菌体负担。(2) CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建。首先构建基因敲除载体系统pHT01-Cas9-donor。在解淀粉芽孢杆菌pyrR基因的45f和181r区通过PAM定位选择合适的靶位点并合成sg RNA。改造pHT01质粒改造,构建质粒pHT01-Cas9。通过酶切酶连操作依次将RBS序列、RepA序列、p43启动子序列、sg RNA序列(45f/181r)和pyrR基因左右同源臂合并序列克隆至pHT01-Cas9载体中,酶切、PCR验证与测序分析均证明pHT01-Cas9-donor载体构建正确。(3)Cas9蛋白表达与pyrR基因诱导敲除。提取质粒pHT01-Cas9-donor,转化解淀粉芽孢杆菌,菌落PCR及酶切验证均表明pHT01-Cas9-donor载体已成功转化解淀粉芽孢杆菌。同时利用IPTG成功诱导Cas9蛋白表达。优化Cas蛋白表达条件,得出Cas9蛋白最优诱导条件为诱导温度30℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为6h。结果表明,pHT01-Cas9-donor敲除系统中各元件均能在解淀粉芽孢杆菌中很好的工作。但在最优诱导条件下,尝试敲除pyrR基因,均未成功,分析原因可能是设计的靶点基因sg RNA未表现活性。(4)两种敲除系统的应用与比较分析。自杀型敲除载体系统和CRISPR-Cas9系统都可以对目标基因组进行定点编辑。自杀型敲除载体系统是传统经典方法,至今仍被广泛应用,但是对于解淀粉芽孢杆菌来说,其转化效率与重组效率较低,且很难将重组到基因组上的抗性基因再替换下来,会给将来工程菌株的生产应用带来麻烦,因此,需要进一步改进该敲除系统或找到另一种更好的替代方法。而CRISPR-Cas9敲除系统具有可供选择位点多、可同时编辑多个位点和识别域,载体构建更简单的特点,且属于无痕敲除,应用前景好。本研究中构建得到可在解淀粉芽孢杆菌中表达Cas9的敲除系统,说明该系统可以很好的发挥功能,但由于只设计了2个靶点基因,数量较少,结果表明sg RNA无活性,故需要进一步设计较多数量的sg RNA,来提高敲除的效率。