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【研究背景】常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是肾脏中最多发的遗传性疾病,大多数患者于成年时发病,人群患病率约为0.1%,中国大约有150万ADPKD患者,而在全球范围内,大约4-6百万人罹患这种疾病。ADPKD有其特发性的病理学转变,由于特定致病基因的突变,双侧肾脏会逐步产生大量的肾脏囊肿,这些大小不等的囊肿呈椭球型,同时还在逐渐增大,对正常的肾脏构造和生理功能造成破坏,到60岁,有大约二分之一的病人会发展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)。ADPKD的首要病发原因是I型多囊肾病基因(PKD1)和II型多囊肾病基因(PKD2)产生突变,造成肾脏上皮细胞的分子生物学功能障碍。目前临床上除肾脏移植外,尚无公认的可用于ADPKD治疗的有效手段和方法。基因治疗被认为是一种全新的极具潜力的疾病治疗手段和方法,通过基因递送技术,利用病毒载体递送PKD2基因至基因突变的细胞,有望成为治疗ADPKD的新方法。【研究目的】本实验通过构建携带人Ⅱ型多囊肾病基因(PKD2)的重组慢病毒,探究慢病毒在修复ADPKD致病基因Pkd2基因敲除的小鼠肾脏上皮细胞多囊蛋白-2(polycystin-2;PC2)的表达及下游Wnt/β-catenin信号通路中的作用。【研究方法】选用XbaI和XhoI酶将PKD2基因从已有pcDNA3.1-TM-PKD2质粒中切出,并插入慢病毒空载体pLV-sfGFP2APuro,测序验证后获得重组慢病毒质粒pLV-sfGFP-PKD2。利用脂质转染技术,将重组慢病毒质粒与包装质粒转染入HEK293T细胞,包装生产慢病毒,获得病毒浓缩液。按照实验组(pLV-sfGFP-PKD2病毒感染)、对照组(pLV-sfGFP病毒感染)和空白组(未感染)进行分组,分别处理携带Pkd2基因的B3、D3细胞(Pkd2+/-)和Pkd2缺失的B2、E8细胞(Pkd2-/-),Western blotting法、免疫荧光染色法检测PC2表达情况。选取B3和B2细胞,利用PCNA免疫荧光染色检测细胞的增殖活性,利用实时定量荧光PCR技术检测PKD2下游Wnt/β-catenin信号通路的变化。【研究结果】重组慢病毒载体酶切后凝胶电泳显示插入片段与PKD2基因一致,基因测序结果显示PKD2插入方向正确。经pLV-sfGFP-PKD2病毒感染后,实验组B2和E8细胞成功表达PC2(0.668±0.013,0.763±0.021),恢复到与空白组B3和D3细胞(0.687±0.015,P=0.164,0.776±0.008,P=0.409)相似的正常水平。实验组B2细胞增殖活性(0.573±0.010)较空白组中B2细胞增值活性显著降低(0.848±0.031,P<0.01),恢复至与空白组B3细胞相似水平(0.585±0.017,P=0.369)。实验组B2细胞中PKD2的重新表达也使Wnt7a、β-catenin、Myc和Cyclin-D1的表达回到正常水平(与空白组B3细胞相比,P>0.05)。【研究结论】本研究成功构建携带人PKD2基因并具有感染能力的重组pLV-sfGFP-PKD2慢病毒,该慢病毒可重建Pkd2基因缺失的小鼠肾脏上皮细胞PC2的表达,使过度激活的Wnt/β-catenin信号通路恢复正常,进而降低PC2缺失所导致的细胞异常增殖活性。