风湿性疾病是目前严重危害人类健康的顽疾,这类疾病病程缓慢、反复发作,临床表现为筋肌、关节沉困酸痛、屈伸不利或变形、僵直,以骨、关节、肌肉疼痛等。治疗此类疾病的化学药物主要以非甾类消炎药、激素、细胞毒药物为主,但副作用大,容易造成药物中毒。传统活血止痛、祛风除湿类中药在治疗此类疾病时副作用小,能标本兼治。因而,人们越来越关注此类中药在治疗风湿性疾病方面的优势。大量临床应用及相关文献表明,活血祛瘀类中药乳香的作用和抗风湿类的类固醇相似,无副作用,不引起胃胀和胃溃疡,其能打通病变经络被,使疼痛得到缓解,“通则不痛”,达到根本治愈的目的。本文提出开发具有现代应用价值的乳香提取物,并对其进行质量控制,达到既保留乳香传统用药的特点,又能发挥其临床应用优势的目的。乳香应用历史悠久,早在魏晋时期就有应用,也是目前中药治疗风湿性疾病的经典代表药物；现代药理研究表明：乳香酸类化合物是具有独特抗炎作用机制、不良反应小的非甾体植物抗炎剂,可望成为治疗风湿性关节炎等疾病的首选药物(印度已有乳香酸的药品上市)。乳香酸类化合物主要通过影响细胞中蛋白激酶通道的传导,抑制细胞信号的传导,抑制人白细胞弹性蛋白酶、5-脂氧合酶及拓扑异构酶的活性,达到其抗炎目的。本课题研究内容主要包括乳香提取物的制备工艺研究、乳香提取物化学成分研究、乳香提取物药理毒理试验研究、建立乳香药提取物特征图谱、建立乳香提取物质量标准、乳香提取物进行稳定性研究。1、乳香提取物的制备工艺研究。根据乳香提取物中有效成分易溶于乙醇,不溶于水的特点,确定乳香提取溶媒为乙醇；以提取率、乳香总有机酸含量、薄层色谱斑点个数为指标,考察不同浓度的乙醇对乳香的提取效果；在此基础上,根据参考文献分别采用乙醇回流提取法、双提法、双提法合并乙醇提取法、乙醇浸渍法对乳香进行提取,以提取物量来衡量不同提取方法的优劣；综合上述研究,采用两因素三水平水平表对乳香提取工艺进行优化,并进行验证得到其最优提取工艺；根据乳香提取物性质,采用三因素量水平正交设计对其纯化方法进行优选,确定了乳香提取物的纯化工艺,并进行验证。最终得到乳香提取物的最佳制备工艺,并进行了验证,证明其适合工业化大生产。2、乳香提取物化学成分分离。利用乳香制备工艺制备乳香提取物,然后通过硅胶柱层析进行粗分,以石油醚-乙酸乙酯为洗脱溶剂,将各个梯度所得馏分合并,得到极性从小到大的10个部分；对粗分及各馏分检测分析,得其含量及保留时间,利用制备液相对其中含量较高组分进行制备,通过重结晶等方法得到其中的单体成分,并根据参考文献,利用紫外、氢谱、碳谱鉴定其化学结构。3、乳香提取物药理毒理试验研究。按照《药品注册管理办法》中药、天然药物注册分类5的要求,进行了乳香提取物药理毒理试验研究。利用药效学试验对乳香抗炎及镇痛作用进行研究,试验观察了不同剂量乳香提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀、大鼠棉球肉芽肿、小鼠迟发型变态反应、小鼠腹腔毛细血管通透性、大鼠佐剂性关节炎的影响及乳香提取物的镇痛作用。药效学试验研究表明,乳香提取物150mg/kg、75mg/kg灌胃给药对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用；可明显抑制冰醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性亢进；对小鼠SRBC(绵羊红细胞)致迟发型足跖肿胀有明显的抑制作用；在100mg/kg、50mg/kg剂量下,对角叉菜胶引起的大鼠足跖肿胀和大鼠棉球肉芽肿具有明显的抑制作用；对大鼠原发性和继发性佐剂性关节炎模型具有明显的治疗作用。在150mg/kg剂量下,对冰醋酸诱发的小鼠腹痛具有较好的镇痛作用。试验选用杂种犬。观察不同剂量的乳香提取物十二指肠给药对麻醉犬血压、呼吸、心电图各项指标及小鼠自主活动的影响,研究其一般药理作用。一般药理研究试验结果表明,乳香提取物100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg十二指肠给药对麻醉犬血压、呼吸、心电图等各项指标与空白对照组比较均无明显差异。试验选用昆明种小鼠。分别观察乳香提取物一次性灌胃和腹腔注射给药对小鼠产生的毒性作用,考察乳香提取物的急性毒性作用。灌胃给药150mg/kg、75mg/kg及37.5mg/kg对小鼠自主活动次数无明显影响。小鼠急性毒性试验表明,20只小鼠一次灌胃给予乳香提取物12.24g/kg,给药后动物未出现明显的毒性反应,无动物死亡；小鼠一次腹腔注射乳香提取物3.01g/kg,亦未出现明显的毒性反应,无动物死亡。利用大鼠及杂种犬对乳香长期毒性作用进行研究。大鼠和犬长期毒性试验,连续给药180天,通过对动物一般情况观察、病理组织学、血液学及血液生化学各项指标的检查,证实大鼠和犬长期毒性试验大剂量组(大鼠：750mg/kg、犬：375mg/kg)动物分别在给药初期出现进食量减少、体重下降等中毒症状,而随给药时间的延长,动物逐渐耐受并自行恢复。各给药组与对照组比较,其血液学、血生化检测、脏器系数和病理组织学检查均无显著差异。试验认为大鼠750mg/kg是可逆性中毒剂量,375mg/kg为安全剂量；犬可逆性中毒剂量是375mg/kg,安全剂量是187.5mg/kg。其中毒靶器官可能是胃肠道。4、建立乳香药提取物特征图谱。根据中药注射剂指纹图谱研究技术要求和国家药典委员会出版的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2004A版)进行相似度评价,采用HPLC-ELSD法建立乳香药提取物的特征图谱,确立乳香提取物特征峰12个。对供试品处理提取溶剂、样品处理提取方法、洗脱系统、色谱柱的进行了选择,并对该方法进行了方法学验证,对提取纯化工艺乳香提取物质量进行控制；保证提取工艺的可重现性,符合国家鼓励中药采用特征图谱控制提取纯化等生产过程的指导思想。5、建立乳香提取物质量标准。参照《中国药典》2010年版一部及新药研究技术要求,对乳香提取物的大类成分总有机酸含量、11-羰基-β-乙酰氧基乳香酸含量、定性鉴别、溶解度、重金属等项目进行了研究,制定了较完善的质量控制标准。6、乳香提取物进行稳定性研究。参照新药研究技术要求,进行了高温、高湿、光照等影响因素实验考察,并进行了加速6个月,室温12个月的稳定性实验研究,为产品包装和有效期的确定提供了依据。结论本研究确定了乳香提取物制备工艺,使有效部位含量达到50%以上,绿色环保,工艺稳定,节约能源、适合产业化生产,避免了中药材投料的质量不可控性；通过药效学试验、一般药理试验及急毒长毒试验等药理毒理试验研究表明,乳香提取物具有明显的抗炎作用,毒副作用小,应用于临床安全有效。同时建立了乳香提取物特征指纹图谱,便于控制药材来源、提取纯化工艺,保障了制剂质量均一。建立的乳香提取物大类成分含量及主要有效成分含量测定方法全方位的控制乳香提取物的质量。综上所述,本文通过乳香提取物的制备,特征指纹图谱的建立,大类成分含量控制、单一主要有效成分含量控制等现代化的质控手段,符合中药现代化的质量可控、安全有效的原则,可以按中药注册5类有效部位申报新药。具有较高的科学价值和临床应用前景。