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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)可引起一种急性、高度接触性传染病。该病流行范围广、死亡率高,严重危害养猪业,是引起仔猪腹泻的重要病原之一。本研究利用RT-PCR及电镜观察法对分离病毒进行鉴定,确认分离到一株猪传染性胃肠炎病毒,通过细胞培养进一步增殖病毒,进行全基因序列分析;同时针对Sa基因设计引物,构建His-Sa表达载体,获得可溶性重组蛋白,将纯化后的表达产物作为包被抗原,建立了 TGEV抗体检测的ELISA方法。1 TGEV-TZ-10-2016的分离及鉴定对江苏地区某养猪场腹泻病料进行病毒的分离,获得一株疑似猪传染性胃肠炎病毒,并将其命名为TGEV-TZ-10-2016。参照文献针对TGEV-Sa基因设计一段特异性引物,用RT-PCR方法进行扩增,获得与预期结果相符的约507 bp目的片段,测序结果显示:TGEV-TZ-10-2016株与已知的TGEV毒株核苷酸同源性在94.6%以上,与中国毒株(PURDUE P115、TGEV-HX、TGEV-SHXB、WH-1、AYU、SC-Y)及美国毒株(PUR46-MAD)同源性均很高,结合电镜观察结果确定该分离病毒为猪传染性胃肠炎病毒。2 TGEV-TZ-10-2016全基因序列分析本研究为获得TGEV-TZ-10-2016病毒的全基因序列的相关信息,将分离得到的TZ-10-2016临床样品在猪睾丸细胞上盲传18代后细胞出现稳定病变,参考GenBank中已发表的TGEV序列,设计合成18对特异性引物,对TGEV-TZ-10-2016进行全基因扩增,再将cDNA序列完成拼接,借助软件进行遗传变异和生物信息学分析。结果显示:TGEV-TZ-10-2016 的完整基因型为 5’-ORF1 a-ORF 1 b-S-ORF3a-ORF3b-sM-M-N-ORF7-3’,TGEV-TZ-10-2016 与 TGEV-SHXB、WH-1、AYU、PUR46-MAD 同源性达到 99.5%;生物信息学分析显示4个结构蛋白中S、sM、M蛋白均为稳定蛋白且有跨膜区,N蛋白有一定的疏水性,四个蛋白都具有良好的抗原性,本研究为猪传染性胃肠炎病毒的基因组学研究提供参考。3间接ELISA方法的建立本研究利用设计的TGEV-Sa基因特异性引物,通过RT-PCR方法,扩增出目的片段,将目的片段克隆进原核表达载体pColdTF,经过双酶切、测序鉴定后,再将正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用终浓度0.5 mM IPTG诱导,表达产物多为可溶性蛋白。超声波裂解菌体后,再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化。经Western-blot鉴定结果正确,重组蛋白的成功表达为下一步病毒抗体检测ELISA方法的建立奠定了基础。利用纯化后的His-Sa重组蛋白作为包被抗原,建立TGEV抗体检测的ELISA方法。通过实验条件的优化,最终确定抗原最佳包被量0.0625 μg/mL,待检血清最佳稀释度1:100,最佳孵育时间45 min,酶标二抗的孵育时间45 min,底物显色时间15 min,用建立的ELISA方法检测40份阴性血清,以确定阳性临界值。当OD450>0.331时,判为阳性。交叉反应性试验发现,本研究建立的间接ELISA方法对TGEV阳性血清反应,对猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的阳性血清不反应,特异性良好。该方法的批内批间实验的变异系数均小于10%,说明该方法重复性良好,用建立好的方法检测282份猪血清样品结果同间接免疫荧光方法比较,结果该方法同间接免疫荧光的检测阳性符合率达100%,阴性符合率达88.3%。本研究建立的间接ELISA方法可用于临床检测。