铅是最常见的环境重金属污染物之一,严重威胁着人类的生存和健康。铅具有明显的雄性生殖毒性,能够导致雄性精子数量的减少,精子活性的降低。目前认为铅能够产生雄性生殖毒性的根本原因之一是：铅能够在睾丸细胞中蓄积从而持续地对睾丸造成损伤。因此,阐明铅从睾丸细胞中排出的机制,减少睾丸细胞中铅的蓄积,促进铅的排出,将有利于防治铅的雄性生殖毒性。多重耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1, MRP1)最早被发现是由于其能够将进入癌细胞中的抗癌药物排出,进而使癌症患者产生耐药性。MRP1在机体组织中广泛表达,尤其在肺、血.脑屏障、肾脏和睾丸中。近些年发现,MRP1不但能够转运抗癌药物还能够转运一些重金属,如汞,镉等。但MRP1与铅转运的关系尚不明确。之前的一些研究认为MRP1转运重金属的过程可能涉及还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)。但是目前GSH参与MRP1转运的具体机制尚不清楚。睾丸支持细胞是睾丸中的重要组成细胞。睾丸支持细胞之间能够形成血-睾屏障结构,同时它能够为输精管中精子的生成提供代谢和结构的支持。因此睾丸支持细胞在生殖中起着重要的作用。本研究通过同源建模、分子虚拟筛选、慢病毒转染RNAi构建稳转株等一系列方法探讨MRP1和GSH在睾丸支持细胞铅蓄积和外排中的作用及机制。研究发现,睾丸支持细胞中铅的蓄积和排出机制与MRP1和GSH有关。该研究将有助于预防和治疗重金属铅对睾丸的损伤,进而推动我国公共卫生事业的发展。目的：(1)通过构建小鼠MRP1的三维蛋白结构模型和分子虚拟筛选,查找出与MRP1结合能力较强的生物小分子,并判断GSH与MRP1结合能力。(2)研究铅对小鼠睾丸支持细胞株(TM4细胞)MRP1的表达及转运活性的影响,初步探讨TM4细胞中铅与MRP1之间的关系。(3)通过慢病毒转染技术构建MRP1稳定低表达的TM4细胞,为探讨MRP1在TM4细胞铅转运中的作用提供技术支持。(4)探讨MRP1和GSH在TM4细胞铅排出和蓄积中的作用,为有效地预防重金属铅的雄性生殖毒性提供实验依据。方法：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模和分子对接通过在线服务器TMpred和ID Protein Structure Prediction Server分别对小鼠的MRP1的蛋白跨膜区域以及蛋白的二级结构进行分析。同时,利用SYBYL软件进行同源建模和分子对接。通过搜索模板、同源识别、序列比对、构建模型保守区域、构建可变循环区域、添加侧链及优化模型一系列步骤对小鼠MRP1的蛋白三维结构进行构建。通过SYBYL软件以及ProSA网站对构建的MRP1结构模型进行评价。通过SYBYL软件计算并搜索MRP1三维结构中可能的小分子结合区域(口袋结构)。最后基于分子对接的方法,对ZINC库中180313种化合物进行虚拟筛选,列出与MRP1蛋白结合能力较强的化合物,并判断GSH与MRP1结合能力。(2)细胞存活率检测以每孔1×105个细胞接种TM4细胞于96孔板中,在培养基中分别加入不同浓度的醋酸铅和各种抑制剂(MK571、BSO、EA、NaN3)培养24h,用CCK8试剂盒检测细胞的存活率。由此筛选本研究中所用醋酸铅以及各种抑制剂的处理浓度。(3) MRP1转运活性检测分别在细胞培养液中加入不同浓度的MRP1活性特异性抑制剂MK571和铅,用酶标仪测定MRP1的转运底物Calcein和SNARF-1的荧光强度,以观察TM4细胞中MRP1转运活性。(4)检测铅对小鼠TM4细胞MRP1表达水平的影响体外培养小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞；利用RT-qPCR和Western blot方法检测TM4细胞MRP1 mRNA和蛋白表达水平；观察不同浓度、不同时间铅处理对TM4细胞内MRP1表达的影响。(5)慢病毒干扰构建稳定低表达MRP1的TM4细胞构建含有MRP1 shRNAs靶序列的穿梭质粒,将穿梭质粒和包装质粒共转染至293T细胞内培养,收集慢病毒并进行病毒滴度检测。将含有目的靶基因的病毒液侵染TM4细胞,通过检测GFP荧光表达测侵染效率。RT-qPCR与Western blot法验证MRP1表达抑制率,通过两种MRP1转运底物Calcein和SNARF-1验证MRP1转运活性抑制率。用嘌呤霉素筛选获得稳定低表达MRP1的细胞株(本研究中简称TM4-sh细胞)(6)细胞内铅蓄积情况的检测以0-100μM醋酸铅分别处理TM4和TM4-sh细胞12h和24h,原子吸收光谱仪检测各浓度组细胞中铅含量。分析随着醋酸铅处理浓度的增加,TM4细胞和TM4-sh细胞中铅的蓄积情况,并比较TM4细胞和TM4-sh细胞中铅蓄积含量的差异。(7)细胞内铅排出情况的检测分别在TM4和TM4-sh细胞培养基中加入终浓度20μM的醋酸铅,培养24小时后,更换为无铅培养基继续培养。分别在更换无铅培养基后的0、1、3、6、9、12h时间点时收集细胞。原子吸收光谱仪测定各时间点上细胞中的铅残留量,比较TM4细胞和TM4-sh细胞中铅排出情况。类同的实验过程观察和分析MRP1活性抑制剂(MK571)、GSH生物合成抑制剂(BSO)、GST活性抑制剂(EA)和能量抑制剂(NaN3)对TM4细胞铅排出的影响。(8)数据统计SPSS (version 17.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)软件对实验数据进行处理分析,每个实验组实验至少重复3次。用非配对t检验比较两组间均数的差异；用ANOVA(Tukey’s post hoc test)分析三组以及三组以上均数之间的差异。所得数据用nean±SD表示,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果：(1)小鼠MRP1蛋白的同源建模与基于分子对接的虚拟筛选通过SYBYL软件对小鼠的MRP1蛋白进行同源建模,并对构建的模型进行优化,然后绘制出小鼠MRP1蛋白的三维结构。并通过Ramchandran (Psi-Phi)和ProSA网站对构建的MRP1结构模型进行评价,结果显示构建的蛋白结构模型中几乎所有的氨基酸残基(97.55%)均位于可接受的范围内；通过对模型的能量进行分析发现,构建的蛋白模型中保守区域的能量较低,说明模型的保守区域相对稳定。综上结果说明本研究中构建的小鼠MRP1蛋白三维结构模型成功。将ZINC的生物合成小分子库中的180313个小分子化合物分别与MRP1进行基于分子对接的虚拟筛选,并列出与MRP1对接总评分前十的化合物。结果发现GSH与MRP1的对接总评分为9.448,位居第八。GSH是与MRP1对接评分前十的化合物中唯一含有巯基的化合物,它被认为在MRP1转运重金属的过程中发挥着重要的作用,该结果也为探索GSH参与MRP1转运底物的机制提供了基于结构的理论基础。(2)TM4细胞具有MRP1的转运活性,铅能够诱导MRP1转运活性的增加在TM4细胞中加入0-100μM剂量浓度范围内的MRP1的活性抑制剂(MK571),检测Calcein和SNARF-1的荧光强度。结果显示MK571能够剂量依赖性的增加TM4细胞内Calcein和SNARF-1的含量,即加入MRP1活性抑制剂MK571后,细胞中残留的MRP1转运底物含量增加。该结果说明TM4细胞具有MRP1的转运活性。在TM4细胞中加入一定浓度范围的醋酸铅,观察到随着加入醋酸铅浓度的增加,细胞内残留的Calcein和SNARF-1的量下降,并呈剂量依赖关系。该结果表明铅能够诱导TM4细胞中MRP1的转运活性。(3)铅能够诱导小鼠中MRP1的mRNA与蛋白表达水平的改变在TM4细胞中分别加入0-100pM的醋酸铅,细胞存活率呈先上升后下降的趋势,且当加入的醋酸铅浓度达到100μM时,细胞的存活率只有54%(P<0.05)。随着给予铅浓度的增加,MRP1 mRNA表达水平呈先升高后降低的趋势,且与对照组(OμM组)相比,给予20、40和80μM的醋酸铅,MRP1 mRNA表达分别相对增高了7、10和7倍,差异有统计学意义(P<0.05)。以20μM醋酸铅分别处理TM4细胞3、6、12、24和48小时,结果显示铅处理超过24小时后,MRP1 mRNA的表达水平显著增加(P<0.05)。时间和剂量曲线显示MRP1蛋白表达水平变化趋势与mRNA水平变化趋势一致,然而蛋白水平变化的倍数没有mRNA改变的明显。(4)通过慢病毒转染技术成功构建了稳定低表达MRP 1的TM4细胞根据基因库小鼠MRP1基因(Gene ID:NM 008576.3)序列,设计4个靶点干扰序列,采用慢病毒载体技术构建稳定低表达MRP1的TM4细胞4个候选株。根据RT-qPCR和Western blot验证,结果确定出MRP1表达敲低效果最为明显的一株,并命名为TM4-sh细胞。RT-qPCR和Western blot的结果显示：TM4-sh细胞中MRP1的mRNA和蛋白表达均较TM4细胞分别降低了73%和75%,差异有统计学意义(P<0.01)。MRP1的特异转运底物SNARF-1和Calcein在TM4-sh细胞内未转运量较TM4细胞显著增加(P<0.01),且TM4-sh细胞中的SNARF-1未转运量高出TM4细胞350%。这些结果证实本研究中构建的TM4-sh细胞被有效地敲低了MRP1基因表达和转运活性。(5)铅在TM4-sh细胞中的蓄积量显著高于TM4细胞,且铅的蓄积与铅处理浓度呈现剂量依赖关系。以0-100μM醋酸铅分别培养TM4和TM4-sh细胞,在12和24小时后,检测各浓度组细胞中的铅含量。结果显示随着铅浓度增加,细胞内的铅蓄积量明显增加(P<0.05)。与TM4细胞组相比,TM4-sh细胞中的铅蓄积更加明显；尤其以10-40μM的醋酸铅处理细胞12和24小时后,TM4-sh细胞中的铅含量较TM4细胞中高出2到8倍(P<0.05)。(6)敲低TM4细胞的MRP1表达水平或抑制MRP1活性能显著延缓细胞内铅的排出根据细胞存活率和预实验结果,以20μM醋酸铅分别处理TM4和TM4-sh细胞24小时,然后更换为无铅培养基继续培养0、1、3、6、9和12小时。收集各时间点细胞,检测细胞内铅残留量,结果以0时间点细胞内铅含量的百分比表示。结果显示更换为无铅培养基1小时后,TM4-sh细胞内仍然残留有75.0%的铅,较同时间点TM4细胞铅高出41.8%。在随后的3、6、9h时点, TM4-sh细胞内持续显示含有较高的铅残留量,且较TM4细胞平均高出23.4%(包括1h时点),各时点差异均有统计学意义,P<0.05。同样以20μM醋酸铅处理TM4细胞24h后,更换含MRP1活性抑制剂(MK571)的无铅培养基继续培养0、1、3、6、9和12小时,MK571组在第3-12小时各点细胞内铅的相对残留量均高于对照组(P<0.05)。(7)GSH和GST参与TM4细胞铅排出,且铅排出依赖ATP加入1mM的ATP的抑制剂(NaN3)培养24小时与对照组(0mM的NaN3)相比细胞内ATP含量显著降低(P<0.01)。加入NaN3组,细胞中ATP含量只有对照组的48.7%。加入25μM GSH的抑制剂(BSO)培养24小时,较对照组(0μMBSO)相比细胞内GSH含量显著降低(P<0.01),且只有对照组细胞中GSH含量的52.3%；加入50μM GST的抑制剂(EA)后,与对照组(OμM EA)相比细胞中GST活性显著降低(P<0.01),只有对照组细胞中的GST活性的28.7%。TM4细胞经20μM醋酸铅培养基培养24小时后,弃掉旧培养基,分别换用含有或不含有GSH合成抑制剂BSO、GST活性抑制剂EA和能量抑制剂NaN。的无铅培养基继续培养,并分别在更换培养基后第0、1、3、6、9和12小时收集细胞,原子吸收分光光度法检测细胞内铅残留量。在同一处理组内,随着排铅时间的延长,各处理组铅的相对残留量呈现先急后缓的下降趋势,其中第0小时至第3小时内降速明显,3小时后降速缓慢。在排铅的第1-9小时各时点,NaN。组细胞中铅相对残留量显著高于对照组(不含NaN3组),P<0.01；在排铅的第3-12小时各时点,BSO组细胞内铅相对残留量均高于对照组(不含BSO组),P<0.01；在排铅的第3和9小时时点上,EA组细胞内铅的相对残留量也均高于对照组(不含EA组),P<0.05。这些结果说明GSH含量的降低、抑制GST活性和抑制细胞需要的能量都不利于TM4细胞内铅的外排。结论：(1)MRP1蛋白三维结构与GSH具有较强的结合力。因此,MRP1可能具有转运GSH结合物的结构基础。(2)TM4细胞具有MRP1的转运活性,铅能够影响TM4细胞中MRP1的转运活性。且铅能够诱导TM4细胞中MRP1的mRNA和蛋白表达水平的改变。(3)本研究通过慢病毒干扰技术成功构建了稳定低表达MRP1的TM4细胞(TM4-sh)。TM4-sh细胞中MRP1的mRNA和蛋白表达水平显著降低,且MRP1的转运活性也被明显抑制。(4)敲低TM4细胞的MRP1表达水平或抑制其活性能够显著增加铅在细胞中蓄积,并延缓细胞内铅的排出。GSH含量的降低、抑制GST活性或者抑制细胞需要的能量都不利于TM4细胞内铅的外排。因此,MRP1参与了TM4细胞铅转运,且依赖于ATP和GSH。