心脏重构（cardiac remodeling, CR）指一系列可造成心肌组织及血管重构的病理过程，早期表现为心肌肥厚，晚期则表现为心脏扩大、心力衰竭。但其机理尚有待进一步明确。近年研究表明心肌细胞内 Ca2+平衡的失调是导致心肌肥厚的最基本因素。钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, Ca2+/CaMKⅡ)是一种多功能的蛋白激酶,作为Ca2+信号转导的关键因子，能够调节细胞多种功能。CaMKⅡ通过调节钙代谢的各个环节来影响心肌细胞信号传导和兴奋-收缩偶联。有研究表明，在心肌肥厚或心衰等心脏重构过程中, CaMKⅡ细胞内表达升高。　　CaMKⅡ有α、β、γ和δ四种亚型，它们分布于不同组织。心脏组织中主要表达CaMKⅡ的δ亚型。CaMKⅡδ亚型由于外显子14、15或者16可变剪接，可表达A、B、C多种CaMKⅡδ变异体（isoform）。CaMKⅡδA含有外显子15和16，但不含有外显子14（含有核定位信号，Nuclear locolizaton signal, NLS)，主要分布在心脏细胞的T管区。前期研究发现正常机体内CaMKⅡδ外显子14，15和16的可变剪接受着严格的调节控制，一旦此可变剪接的调节发生紊乱，会造成A、B和C三种变异体的表达失衡，导致心肌细胞正常功能的丧失而引起心脏疾病。　　前期围绕CaMKⅡδ可变剪接的离体细胞研究发现：细胞内存在双特异性络氨酸磷酸化调节激酶1A(dual-specificity tyrosine-phosphorylated and regulated kinase1A, Dyrk1A)经可变剪接因子因子（alternative splicing factor，ASF）调控CaMKⅡδ的可变剪接的信号通路。本课题在前期研究的基础上，探讨该通路在多种原因所致的心脏早期重构——心肌肥厚中的作用。　　胞内钙离子浓度升高不仅可活化钙依赖的蛋白激酶，还可以活化钙/钙调素活化的磷酸酶。钙调神经磷酸酶（calcineurin, CaN）是迄今发现的唯一受钙/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，活化后可导致下游底物——NFAT的去磷酸化并核转移，活化抗凋亡和肥厚基因，从而在多种原因所致的心肌肥厚中发挥重要作用，抑制CaN信号通路可预防和逆转心肌肥厚。传统认为CaN的活化是由胞内钙离子浓度升高致CaN变构，抑制区移位所致，前期我们发现CaN的活化还存在蛋白和基因水平的调节，活化的CalpainⅠ可导致CaN含自主抑制区的羧基端的蛋白水解，致CaN的持续活化。近期有关CaMKⅡ与CaN关系的研究发现CaMKⅡ的活化可导致CaN的磷酸化，从而抑制CaN活性和NFAT的核转移。据此我们推测CaMKⅡδ可变剪接的信号通路还存在对CaN功能的调节。　　本课题旨在探讨CaMKⅡδ可变剪接和CaN去磷酸化调控在多种原因（基因突变、体液因素活化、压力超负荷）所致心脏早期重构——心肌肥厚中的作用；和CaMKⅡδ可变剪接的信号通路对CaN去磷酸化调控的影响。　　研究目的：　　1、探讨CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控在基因突变所致心肌肥大中的作用。　　2、探讨CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控在体液因素活化所致心肌肥厚中的作用。　　3、探讨CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控在压力负荷增加所致心肌肥厚中的作用。　　研究方法：　　1、构建大鼠心肌肌钙蛋白ⅠD128Y基因突变重组腺病毒载体，经DNA测序、免疫印迹和细胞培养等方法鉴定成功后，病毒扩增纯化，确定MOI后，转染培养的大鼠心肌细胞。镜下观察细胞形态结合实时PCR检测ANF和BNP mRNA表达证实细胞肥大后，蛋白免疫印迹和 PCR及活性测定检测胞内 CaN、calpainⅠ、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的变化。　　2、两肾一夹法制定肾血管性高血压大鼠心肌肥厚模型，分别给予Dyrk1A抑制剂EGCG、Harmine，或血管紧张素受体阻滞剂缬沙坦干预，检测大鼠血压，行心脏重量学和病理学测定作为大鼠肥厚指标，蛋白免疫印迹和PCR及活性测定检测胞内CaN、calpainⅠ、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的变化。　　3、腹主动脉缩窄法制定压力负荷增加的大鼠心肌肥厚模型，分别给予Dyrk1A抑制剂EGCG、交感神经抑制剂美托洛尔和calpainⅠ抑制剂干预，检测大鼠血压，同时行心脏重量学和病理学测定作为大鼠肥厚指标，蛋白免疫印迹和PCR及活性测定检测胞内CaN、calpain、Dyrk1A、ASF和CaMKⅡδ的变化。　　研究结果　　（一）CaMKⅡδ可变剪接及 CaN去磷酸化调控在基因突变致大鼠心肌肥大中的作用　　1、大鼠心肌肌钙蛋白ⅠD128Y基因突变重组腺病毒载体构建：　　构建大鼠心肌肌钙蛋白ⅠD128Y基因突变重组腺病毒载体，经DNA测序、免疫印迹和细胞培养等方法鉴定证实。　　2、CaN去磷酸化调控在cTnⅠD128Y突变致大鼠心肌肥大中的作用：　　与空白对照组、阴性病毒对照组或野生型cTnⅠ基因转染组相比，cTnⅠD128Y突变基因转染组心肌细胞增大，胞内ANF、BNP mRNA表达上调，同时CaN活性增加和mRNA表达上调。CaN抑制剂CsA或FK506干预在降低CaN活性和mRNA表达同时，大鼠心肌细胞缩小、胞内ANF、BNP的mRNA表达下调。　　3、CaMKⅡδ可变剪接调控在cTnⅠD128Y突变致大鼠心肌肥大中的作用：　　与对照组相比，cTnⅠD128Y突变基因转染组心肌细胞内ANF、BNP mRNA表达上调，心肌细胞增大同时，胞内存在CaMKⅡδ蛋白表达上调、可变剪接紊乱，胞浆内ASF表达下降及Dyrk1A蛋白表达上调和活性增加，CalpainⅠ蛋白表达及活性升高。　　与单纯转染 cTnⅠD128Y突变基因组相比，突变病毒转染并 Dyrk1A抑制剂EGCG或Harimen干预组细胞重构改善同时CaMKⅡδ蛋白表达下调、可变剪接紊乱改善，胞浆内ASF表达增加及Dyrk1A蛋白表达下调和活性下降，但Calpain I蛋白表达及活性无变化。　　与仅转染 cTnⅠD128Y突变基因组相比，突变病毒转染并 Calpain抑制剂MDL28170干预组在细胞重构改善同时，存在CalpainⅠ蛋白表达下调、活性下降， CaMKⅡδ蛋白表达下调、可变剪接紊乱改善，胞浆内ASF表达增加及Dyrk1A蛋白表达下调和活性下降。　　（二）CaMKⅡδ可变剪接及 CaN去磷酸化调控在神经体液因素活化的肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用：　　1、CaMKⅡδ可变剪接调控在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用：　　与假手术组相比，两肾一夹术后8周，两肾一夹组大鼠在血压升高，左室重与体重比值增加，并心肌细胞面积增大同时，大鼠心肌CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达上调及ASF表达下降；与两肾一夹组相比，Dyrk1A抑制剂EGCG或Harnine干预组在不降低血压情况下抑制大鼠心肌肥厚，改善CaMK IIδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达下调及胞浆ASF蛋白表达升高（P<0.05）。　　2、CaMKⅡδ可变剪接调控及逆转机制在缬沙坦预防肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用：　　与假手术组相比，两肾一夹术后8周，手术组大鼠在血压升高同时发生心肌肥厚，心肌CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达上调及ASF表达下降；与两肾一夹组相比，血管紧张素受体阻滞剂缬沙坦干预组血压显著下降，心肌肥厚程度减轻同时，CaMKⅡδ可变剪接紊乱改善、Dyrk1A蛋白表达下调及胞浆ASF蛋白表达升高（P<0.05）。　　3、缬沙坦经抑制CalpainⅠ、CaN和CaMKⅡδ可变剪接预防肾血管性高血压大鼠心肌肥厚：　　与假手术组相比，两肾一夹术后8周，手术组大鼠在血压升高、心肌肥厚同时，心肌中CaN的mRNA、蛋白表达上调，活性增加；CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Calpain蛋白表达上调。与两肾一夹组相比，缬沙坦干预组血压显著下降，心肌肥厚程度减轻同时，CaN的活性、mRNA及蛋白表达均下降，CaMKⅡδ可变剪接紊乱改善、CalpainⅠ蛋白表达下调（P<0.05）。　　（三）CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控在压力超荷致大鼠心肌肥厚中的作用　　1、CaMKⅡδ可变剪接调控在腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚中的作用　　腹主动脉缩窄的方法建造压力负荷增加的大鼠模型。术后4周，与假手术组相比，手术组大鼠血压显著升高，并心肌肥厚，同时大鼠心肌CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达上调及ASF表达下降；与手术组相比，Dyrk1A抑制剂EGCG干预组在不降低血压情况下抑制大鼠心肌肥厚，改善 CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达下调及胞浆ASF蛋白表达升高（P<0.05）。　　2、美托洛尔对腹主动脉缩窄大鼠心肌CaMKⅡδ可变剪接调控的影响　　与假手术组相比，腹主动脉缩窄术后4周，手术组大鼠在血压升高同时发生心肌肥厚，心肌CaMKⅡδ可变剪接紊乱、Dyrk1A蛋白表达上调及ASF表达下降；与手术组相比，交感神经β受体阻滞剂美托洛尔干预组血压显著下降，心肌肥厚程度减轻同时，CaMKⅡδ可变剪接紊乱改善、Dyrk1A蛋白表达下降及胞浆ASF蛋白表达上调（P<0.05）。　　3、MDL28170对腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚的影响：　　与假手术组相比，两肾一夹术后8周，手术组大鼠在血压升高、心肌肥厚同时，心肌中CaMKⅡδ可变剪接紊乱、CaN的mRNA、蛋白表达上调，活性增加，并Dyrk1A蛋白表达上升及ASF表达下调，Calpain蛋白表达上调。与手术组相比， MDL28170干预组在不影响血压情况下，心肌肥厚程度减轻同时，CaMKⅡδ可变剪接紊乱改善，CaN的活性、mRNA及蛋白表达均下降，Dyrk1A蛋白表达下调及胞浆ASF蛋白表达增加，CalpainⅠ蛋白表达下降（P<0.05）。　　结论　　1、CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控通路参与了cTnⅠD128Y基因突变所致的心肌肥大。　　2、CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控通路参与了两肾一夹所致大鼠心脏早期重构——心肌肥厚的过程；缬沙坦可通过调控这些胞内信号传导通路预防肾血管性高血压大鼠心肌肥厚。　　3、CaMKⅡδ可变剪接及CaN去磷酸化调控通路参与了腹主动脉缩窄所致大鼠心肌肥厚过程；美托洛尔可通过调控这些信号通路预防压力超负荷所致的心肌肥厚。CallpainⅠ-Dryk1A-ASF-CaMKⅡδ的信号通路参与对CaN的调控。