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肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是以胶原为主的细胞外间质（extracellular matrix, ECM）成分在肝内过多沉积所致。在肝脏受到慢性损伤时,纤维组织生成,如果不及时去除刺激因素,纤维组织则持续增生,从而形成肝硬化。肝纤维化是肝硬化发生发展的必经途径,肝纤维化是可逆的,而肝硬化则难以逆转。因此,研究肝纤维化的发病机制,从而阻断甚或逆转肝纤维化非常关键。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝脏窦状隙周围细胞,正常情况下处于静止状态,炎症、损伤等因素可以使其激活,产生大量以胶原为主的ECM成分和各种细胞因子。HSC是肝脏主要的纤维生成细胞,其活化、增殖可以启动整个肝纤维化过程,是肝纤维化形成的中心环节。HSC活化后难以恢复静止状态,肝脏主要通过细胞凋亡机制来去除活化HSC,而这恰是肝纤维化发生逆转的关键所在。因此,抑制HSC活化、增殖,诱导活化的HSC凋亡对逆转肝纤维化意义重大。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸至非肿瘤领域。我们的前期研究发现在胆总管结扎（bile duct ligation,BDL）大鼠肝纤维化模型中,PTEN与在体大鼠HSC活化、增殖呈负相关,与HSC凋亡呈正相关。而PTEN在肝纤维化逆转中的表达改变尚未见报道,本研究旨在阐明PTEN在肝纤维化发病以及自发逆转过程中的表达改变,并探讨其动态表达与HSC增殖、凋亡的关系,从而为寻求有效预防和逆转肝纤维化的新策略提供实验依据。目的:研究PTEN在大鼠肝纤维化及自发逆转过程中的表达改变及其与在体HSC增殖、凋亡的关系。方法:使用成年健康雄性Wistar大鼠108只,随机分为模型组（30只）、模型对照组（30只）、逆转组（24只）、逆转对照组（24只）,进行四肢轮流皮下注射40% CCl4橄榄油溶液(2 ml·kg-1,2次/周)共5周建立大鼠肝纤维化模型,模型建立成功后停止应用CCl4并正常饲养4周建立肝纤维化自发逆转模型,正常大鼠作为对照组,造模过程中大鼠无死亡。利用Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）、Masson’s trichrome staining（MT染色）方法观察肝脏病理学改变,免疫荧光方法检测大鼠肝组织中PTEN及α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表达;采用免疫荧光双标记法利用激光扫描共聚焦显微镜测定在体活化HSC以及凋亡细胞中PTEN的表达改变;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记（TUNEL）及α-SMA免疫荧光双标记方法检测在体活化HSC的凋亡;Western blot和real-time ?uorescent quantitation PCR（real-time PCR）检测PTEN蛋白及mRNA在大鼠肝组织中的表达。结果:①H&E和MT染色结果显示:CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型和自发逆转模型成功建立,随着CCl4用药时间的延长,肝细胞变性坏死逐渐增多,大鼠肝纤维化程度逐渐加重;在停止注射后,随着自发逆转时间延长,已形成的纤维组织逐渐减少,肝细胞逐渐恢复正常形态,再生肝细胞增多;②α-SMA免疫荧光染色显示:对照组正常大鼠肝组织中,α-SMA仅在血管壁平滑肌细胞有表达,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk和5 wk时大鼠肝组织内α-SMA的累积阳性光密度值（0.51±0.02,0.74±0.02,1.29±0.02,1.40±0.01,1.65±0.02）均显著高于对照组（0.07±0.01）,P<0.01;且各组之间均有显著性差异（P<0.01）;而在自发逆转组,随着自发逆转时间的延长,造模Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk和Re 4 wk免疫荧光结果显示α-SMA阳性表达（1.31±0.11, 1.14±0.03, 0.97±0.01, 0.55±0.11）逐渐降低,但仍显著高于对照组（0.12±0.04）,并且各组之间有显著性差异,P<0.01;③PTEN免疫荧光染色显示:正常大鼠肝组织中PTEN蛋白广泛表达于细胞浆,随肝纤维化进展,PTEN阳性细胞主要分布于纤维间隔、汇管区及增生的胆管周围细胞处。造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠肝组织内PTEN蛋白的阳性光密度值逐渐降低（2.23±0.02, 1.96±0.03, 1.61±0.02, 1.37±0.02, 0.98±0.01）并显著低于对照组（2.67±0.02）,P<0.01;各组之间均有显著性差异（P<0.01）。在逆转组,随着停药时间的延长,PTEN蛋白表达逐渐回升（1.01±0.11, 1.46±0.09, 1.62±0.22, 1.99±0.30）,由汇管区表达增加逐渐广泛表达于肝小叶其它部位,但仍低于对照组（2.31±0.12）,各组之间具有显著性差异,P<0.01;④Western blot分析显示,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白表达量（1.33±0.10, 1.12±0.13, 0.83±0.10, 0.55±0.08, 0.41±0.09） ,均显著低于对照组（1.75±0.32）,P<0.01;且各组之间比较也均有显著性差异（P<0.01）,即大鼠肝纤维化越重PTEN蛋白表达越低。在逆转组,造模Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中PTEN蛋白表达量（0.10±0.03, 0.21±0.05, 0.36±0.08, 0.44±0.06）,呈逐渐升高的趋势,且各组之间具有显著性差异（P<0.01）;⑤应用实时荧光定量PCR,采用相对定量2-△△Ct法比较PTEN mRNA在各组大鼠肝组织中的表达,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk肝组织中PTEN mRNA相对对照组的表达倍数为0.67±0.01, 0.58±0.04, 0.48±0.02, 0.38±0.04, 0.28±0.08,均显著低于对照组,并随肝纤维化的加重而逐渐降低,P<0.01。而在逆转Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中,PTEN mRNA的相对表达倍数分别为0.53±0.01, 0.74±0.01, 0.80±0.03, 0.93±0.06,仍低于对照组,各组之间均有显著性差异,P<0.01;⑥PTEN和α-SMA在HSC的共表达产物,主要存在于活化HSC细胞浆,并且共表达区域以汇管区和纤维结缔组织区域为主,共聚焦激光扫描显微镜图像分析结果显示,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠肝组织中PTEN表达阳性的活化HSC占总的活化HSC的比例分别为（0.90±0.05, 0.75±0.03, 0.41±0.03, 0.29±0.02, 0.23±0.03）。即随着肝纤维化的进展,活化HSC中PTEN表达逐渐降低。在逆转Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk组中,活化HSC中PTEN表达逐渐上升,并且具有显著性差异（0.35±0.02, 0.57±0.02, 0.66±0.02, 0.71±0.02） （P<0.01）;⑦TUNEL及α-SMA免疫荧光双重染色显示:正常大鼠肝组织未见凋亡HSC,随肝纤维化程度加重,活化HSC增多,凋亡HSC也随之增多,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk,大鼠肝组织活化HSC凋亡指数（7.12±0.03, 6.35±0.02, 4.11±0.02, 3.68±0.02, 1.50±0.03）显著高于对照组,随着肝纤维化病变加重,活化HSC凋亡的比例逐渐减少（P<0.01）。而停药后,随着肝纤维化的自发逆转,活化HSC的凋亡指数显著增加（1.20±0.23, 1.35±0.12, 4.20±0.17, 6.51±0.45, P<0.01）,凋亡的活化HSC主要集中在汇管区及纤维组织区域;⑧共聚焦激光扫描显微镜下观察TUNEL及PTEN免疫荧光双重染色的大鼠肝组织冰冻切片,正常大鼠和模型1 wk组大鼠肝组织未见凋亡细胞,随肝纤维化程度加重,造模2 wk、3 wk、4 wk及5 wk可见凋亡细胞逐渐增多,PTEN阳性的凋亡细胞比例逐渐降低（0.70±0.01, 0.64±0.01, 0.50±0.02, 0.33±0.01）,P<0.01。而在逆转组,PTEN阳性的凋亡细胞和凋亡细胞进一步增多,其比例在Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中逐渐升高（0.78±0.02, 0.80±0.01, 0.92±0.02, 0.95±0.02）;⑨对PTEN免疫荧光染色结果与α-SMA免疫荧光染色结果、PTEN阳性的活化HSC比例、活化HSC凋亡指数及PTEN阳性的凋亡细胞比例进行Pearson’s相关性分析,结果显示,大鼠纤维化肝组织中PTEN表达与α-SMA的表达呈显著性负相关,与PTEN阳性的活化HSC比例呈显著性正相关,与活化HSC凋亡指数呈显著性正相关,与PTEN阳性的凋亡细胞比例呈显著正相关,r值分别为-0.979、0.962、0.991、0.979,P<0.05。结论:CCl4诱导的大鼠肝纤维化病变进展中肝组织及其HSC的PTEN表达下调,而停药后的自发逆转进程中肝组织及HSC的PTEN表达上调,提示PTEN可能通过抑制HSC的活化、增殖和诱导活化HSC发生凋亡而成为治疗肝纤维化的新靶点。