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拟南芥基因组和水稻基因组测序工作的完成,全面揭开了植物蛋白质组学研究的序幕。全景式的蛋白质的亚细胞定位、蛋白质与蛋白质之间相互作用以及蛋白质的动态变化等成为生物学家们关注的热点。其中,蛋白质的亚细胞定位研究对于系统地理解植物形态建成、生长发育甚至逆境耐性等都是必不可少的环节,也是功能基因组学的重要内容。另外,蛋白质拓扑结构的研究是了解蛋白质三维结构和功能的重要途径。维生素K环氧化物还原酶(VKOR)是一种存在于人类和哺乳动物内质网上的膜蛋白,人们对于VKOR及其同源蛋白的研究主要集中在哺乳动物以及原核生物中,而对植物VKOR同源物的研究几乎是一片空白。因此,我们选取拟南芥VKOR作为研究对象对高等植物的VKOR的定位与结构进行初步研究。本研究通过生物信息学软件的应用,预测拟南芥VKOR的亚细胞定位以及拓扑结构,通过GFP融合蛋白瞬时表达实验验证其亚细胞定位,并利用碱性磷酸酶融合手段分析该蛋白的拓扑结构,具体结果如下:(1) VKOR编码蛋白的亚细胞定位及信号肽预测。根据NCBI发布的拟南芥VKOR的基因,At4g35760,利用TargetP、PredSL、BaCello、SLPFA、SLP-Local和ChloroP等在线程序预测该基因编码蛋白的亚细胞定位,综合各种预测结果表明该蛋白很可能定位于叶绿体,而且编码蛋白的N末端有一段45个氨基酸长度的的叶绿体信号肽。(2)GFP融合表达载体的构建。设计特异性引物从拟南芥cDNA文库中克隆得到拟南芥VKOR的基因,并以此为模板扩增信号肽序列(Transit Peptide, TP),插入到植物表达载体pJIT163-gfp的绿色荧光蛋白基因gfp序列N端,构建GFP融合表达载体pJIT163-TP-gfp。(3)利用原生质体瞬时表达技术,确定拟南芥VKOR的亚细胞定位。利用PEG介导法将pJIT163-TP-gfp和pJIT163-gfp质粒分别转化拟南芥原生质体,23℃培养12-16小时,激光共聚焦显微镜观察原生质体。以pJIT163-gfp作为阴性对照,其表达的GFP蛋白发出的绿色荧光分布于细胞质中;而pJIT163-TP-gfp表达的TP-GFP融合蛋白的绿色荧光与叶绿体的自发红色荧光重合,结果表明,VKOR定位于拟南芥叶绿体中,其信号肽是从N端起始的前45个氨基酸。(4) VKOR蛋白的拓扑结构预测。根据拟南芥VKOR的氨基酸序列,利用TMHMM、HMM-TM、TMPred、TOPCONS、SOSUI、PHILIUS、PolyPhobius、HMMTOP和THUMUP等在线程序预测拟南芥VKOR的拓扑结构,结果表明,完整的VKOR蛋白包含2个结构域,膜结构域(AtVKOR)和硫氧还蛋白结构域(AtDsbA),其中AtVKOR结构域可能包含4-5个跨膜区。(5)利用碱性磷酸酶融合技术研究VKOR的拓扑结构。膜蛋白与碱性磷酸酶融合后,根据碱性磷酸酶活性的变化可以指示膜蛋白面向膜的内侧或外侧。根据生物信息学预测的拓扑结构,设计各特异性引物,分别PCR扩增VKOR各跨膜区之前的序列,即从N端至不同跨膜区位点,将扩增的各片段插入到原核表达载体pDHB7744的碱性磷酸酶基因序列的N末端,构建5个VKOR片段与碱性磷酸酶的融合表达载体,转化大肠杆菌,测定碱性磷酸酶活性,研究VKOR蛋白拓扑结构。(6)利用改良的碱性磷酸酶融合技术确定VKOR蛋白在叶绿体中的拓扑结构。由于碱性磷酸酶融合技术表达的酶活性不够规律,为了确定VKOR的拓扑结构,我们利用改良的碱性磷酸酶融合技术即“三明治”(膜蛋白-碱性磷酸酶-膜蛋白)技术进行了进一步研究。PCR扩增每个融合片段的各剩余的VKOR片段序列,利用上述构建的碱性磷酸酶的融合表达载体,插入到各融合表达载体的AP序列的C末端,共构建7个“三明治”融合表达载体。融合表达载体转化大肠杆菌,在含有诱导物IPTG以及碱性磷酸酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(XP)的固体培养基上,37℃培养2天,检测各融合表达载体的碱性磷酸酶活性。其中有3个融合位点表现出高碱性磷酸酶活性,4个融合位点处活性很低,根据以上结果,我们给出了VKOR蛋白可能的拓扑结构:含有4个跨膜区和1个可能的部分插入片段,其N端和C端都位于周质/类囊体腔中,并且4对保守的半胱氨酸均面向周质/类囊体腔。