论文部分内容阅读
麦芽三糖酶（α-maltotriohydrolase,EC 3.2.1.116）,是糖苷水解酶家族GH13中的一员,也归属于麦芽低聚糖酶。麦芽低聚糖酶一般定义为外切型α-淀粉酶,广泛应用于淀粉改性和烘焙食品的淀粉回生控制等。目前普遍认为麦芽三糖酶的作用机制为通过内切方式作用于淀粉生成麦芽三糖,然而其具体作用机制并未明确。麦芽三糖酶等麦芽低聚糖酶的作用机制的不明晰,严重制约了其在食品工业中的应用。本课题由来源于Microbacterium imperiale的麦芽三糖的纯化制备入手,探析该酶的催化水解作用机制,及其在淀粉回生和消化性调控方面的应用,并利用新发现的该酶的转糖基活性对甜菊糖苷进行酶法改性,为其在食品工业的应用奠定基础。首先,采用透析、HiTrap Desalting脱盐柱凝胶色谱、HiTrapTM Q fast flow离子交换色谱和超滤离心浓缩等酶分离纯化技术,从商业酶AMT 1.2L中制备得到麦芽三糖酶。利用SDS-PAGE凝胶电泳对所得麦芽三糖酶进行鉴定,所得酶达到电泳纯,相对分子质量约为5.39×104;比酶活力为64.8 U/mg,纯化倍数达到22.5。该酶的基本酶学性质:最适温度为50℃,最适pH为6.5;麦芽三糖酶为Ca2+依赖型淀粉酶,5 mM Ca2+能够有效提高其热稳定性。借助TLC和HPLC分析技术对不同底物的酶解产物进行分析,发现麦芽三糖酶可水解环糊精类底物,验证了其内切活性;底物淀粉的结构（直链淀粉或者支链淀粉）决定了酶解速率和产物中麦芽三糖的纯度。接着,以直链淀粉为底物,比较了不同淀粉酶的多重水解能力:Aspergillus oryzaeα-淀粉酶<猪胰α-淀粉酶≈麦芽三糖酶<β-淀粉酶。借助HPSEC和TLC分别对直链淀粉和麦芽低聚糖衍生物（pNPG5和pNPG6）酶解产物进行分析,证明了麦芽三糖酶通过内外切共同作用的方式水解直链淀粉:首先通过内切方式降低直链淀粉的Mw,进而通过外切方式生成麦芽三糖。进一步借助TLC和HPAEC对麦芽低聚糖的水解产物进行分析发现麦芽三糖酶在水解麦芽低聚糖（DPn,n=4-7）时还表现出转糖基活性,生成DPn±3低聚糖。与此同时,借助TLC证明了葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和pNPG1均可作为麦芽三糖酶转三糖基反应的糖基受体。其次,以支链淀粉为底物,借助HPSEC-MALLS-RI和HPAEC研究了麦芽三糖酶的酶解规律,发现酶先通过外切方式作用于支链淀粉的外链,生成麦芽三糖;随后通过内切方式作用于支链淀粉的内链,显著降低其Mw,并生成新的非还原性末端。利用大麦β-淀粉酶的外切活性作用于支链淀粉,制备得到不同外链长的β-糊精。以支链淀粉和β-糊精为底物,测定酶的酶动力学参数,发现随着平均链长和外链长的降低,底物的米氏常数（Km）不断增大,催化效率(kcat/Km)却显著降低;其中β-糊精3（即β-极限糊精）的Km为支链淀粉的8倍,kcat/Km却仅为支链淀粉的6.5%,这表明支链淀粉的外链比内链更易于被麦芽三糖酶作用,且长外链比短外链更易与酶发生反应。利用DSC研究了淀粉的回生性质,发现麦芽三糖酶作用能够抑制支链淀粉的回生:当支链淀粉水解率>15.9%时,在4℃储藏7 d后并未出现回生焓,表明其回生被完全抑制。结合支链淀粉的酶解机制,推测麦芽三糖酶能够抑制支链淀粉回生的机制是因为支链淀粉的外链被水解生成DP<9的极短链和麦芽低聚糖（麦芽三糖为主）。再次,通过控制麦芽三糖酶的水解时间调控其对普通玉米淀粉的分子结构的改性程度,改善其消化性质。实验发现麦芽三糖酶改性淀粉促进慢消化淀粉（SDS）的形成,其中酶解30 min制备得到的SDS含量最高,达到19.4%,为未经酶处理淀粉1.5倍。借助HPSEC-MALLS-RI,HPAEC和1H NMR对酶改性淀粉的分子精细结构进行解析,得出SDS的增加主要是因为,麦芽三糖酶以外切作用于玉米淀粉中支链淀粉的外链,促使DP<13短链的大量生成和α-1,6糖苷键比率的增加,提高了淀粉的抗酶解性。然后,采用麦芽三糖酶和普鲁兰酶复合处理制备抗性淀粉（RS3）,研究结果表明:反应温度50℃、pH 6.5、麦芽三糖酶添加量12 U/g、反应时间2 h,此时玉米淀粉水解率为13.9%,随后用普鲁兰酶脱支处理,回生48 h后制备得到的样品中RS3含量为40.8%。借助HPSEC和XRD等分析了回生淀粉的链长分布和晶体结构,并采用Pearson相关系数对所得结果进行相关性分析,发现经麦芽三糖酶处理后玉米淀粉脱支淀粉中DP 30-130部分所占比率增加,导致回生淀粉晶型从B型向B+V型转变,同时提高了淀粉相对结晶度和抗酶解性能,从而促进了RS3的形成。为了分析麦芽三糖酶促进抗性淀粉形成的机制,进一步采用HPSEC-MALLS-RI对麦芽三糖酶不同酶添加量酶解得到的玉米淀粉的分子结构进行分析,结果表明麦芽三糖酶通过先外切后作用于支链淀粉,以及内切方式作用于直链淀粉和支链淀粉的内链,有效提高了脱支普通玉米淀粉中DP 30-130所占比率,进而提高RS3的生成量。最后,通过HPLC和UHPLC-MS/MS等分析技术验证麦芽三糖酶的转糖基活性,结果表明:麦芽三糖酶能够选择性的对甜菊糖苷进行转糖基作用,生成产物以麦芽三糖基-甜菊糖苷为主。考察反应条件对于转糖基反应过程中甜菊糖苷转化率的影响,结果表明,在甜菊糖苷15 mg/mL,可溶性淀粉150 mg/m L,pH 6.5,反应温度55℃,酶添加量为40 U/mL,反应时间为3 h的实验条件下,此时甜菊糖苷的转化率最高可达46%。采用大孔树脂D101对酶法改性甜菊糖苷进行精制,并借助感官评价和储藏稳定性试验对其进行评价,发现酶改性甜菊糖苷的甜度为改性前甜菊糖苷1.2倍;储藏28 d,甜菊糖苷、莱鲍迪甙A和麦芽三糖酶改性甜菊糖苷水溶液（1%,w/v）的保留率分别为49.8%,26.2%和70.6%。由此可见,麦芽三糖酶酶法改性能够显著增加甜菊糖苷的甜度,削弱苦涩的后味并提高其水溶液的储藏稳定性。