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腺病毒载体是目前常用的病毒载体,广泛用于疫苗及基因治疗领域。腺病毒作为疫苗载体的优点在于安全性相对较高,易扩增,并且能够刺激机体同时产生特异性体液免疫和细胞免疫。体液免疫反应中由B细胞分化成为浆细胞分泌抗体是机体应对外来病原体的有效预防机制。腺病毒载体疫苗在抗体的快速产生及维持方面有着较大的优势,因此研究腺病毒载体疫苗的体液免疫应答机制对于应急疫苗的理性设计具有重要意义。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）是表达于多种细胞的病原体识别受体,在天然免疫中发挥着重要作用,同时它也能起到连接体液免疫应答的作用。本研究旨在探索腺病毒载体如何通过TLR信号通路激活天然免疫,进而诱导产生特异性体液免疫的机制。根据TLR的分布和结构特点,本研究选择了TLR2、TLR4、TLR7信号通路为研究对象,并以5型腺病毒载体炭疽疫苗（Adenoviral vector serotype5-based anthrax vaccine,Ad5-PA）为免疫原,从抗原递呈和生发中心反应等角度,细胞因子、共刺激分子和转录因子的表达水平等层次,系统研究TLR信号通路在腺病毒载体疫苗免疫应答中的作用机制。本研究首先利用qPCR技术对于Ad5-PA刺激后脾细胞中TLR基因的相对表达量进行了检测,结果显示TLR2、TLR4、TLR7的表达水平均在刺激后发生了上调,提示这几种TLR参与了Ad5-PA的免疫应答。随后,我们分别给相应的TLR缺失小鼠免疫Ad5-PA,流式细胞术和ELISA的检测结果显示:PA特异性抗体的水平,IL-6、TNF-?和IL-1?等炎性因子水平有所下降,浆细胞数量的减少,以及抗原递呈细胞的活化和成熟受损。这些结果表明,由于TLR的缺失,Ad5-PA刺激产生的体液免疫应答在不同程度上受到了影响。利用流式细胞术检测在Ad5-PA免疫后抗原递呈细胞（Antigen presenting cell,APC）表面CD69和CD86分子的表达水平,结果显示Ad5-PA对小鼠的B细胞和NK细胞有明显的活化作用,并且能够显著上调mDC和Mφ细胞表面共刺激分子CD86的表达。与之对应,三种TLR缺失小鼠体内NK细胞的活化能力均明显减弱,但仅在TLR4-KO小鼠中检测到B细胞的活化能力减弱、mDC细胞表面CD86分子表达水平的下调,以及整合素分子CD11b表达水平的下调,发现了免疫后TLR2-KO小鼠体内中性粒细胞（PMN）的数量明显少于WT小鼠,说明相较于TLR2和TLR7,TLR4对于抗原递呈环节的影响更为显著。此外,还利用qPCR技术对Ad5-PA刺激后小鼠巨噬细胞RAW264.7中HMGB1基因的相对表达量进行检测,结果显示HMGB1基因的表达显著升高,进一步提示HMGB1可能是Ad5-PA免疫后TLR4信号通路激活的配体。利用免疫荧光技术对TLR缺失小鼠在Ad5-PA免疫后生发中心（Germinal center,GC）的变化进行了观测,结果显示,TLR4的缺失使得GC在滤泡中的相对面积明显缩小。流式细胞术对TFH和GC B细胞的数量检测结果显示,三种TLR敲除小鼠中GC B的数量都显著减少,其中TLR4的缺失下调了GC B表面Fas分子的表达,以及转录因子Bcl6阳性TFH细胞的数量,进而可能影响TFH对于GC B细胞的辅助作用;TLR7的缺失使得TFR数量增加,TFH细胞中增殖细胞的比例降低,是最终导致TFH细胞数量减少的可能原因之一,并可能影响后续GC B细胞的分化;TLR2的缺失使得GC B细胞中Bcl6的表达水平降低,对GC B细胞分化发育和功能的发挥都可能产生影响。上述结果表明,三种TLR信号通路参与了GC B分化过程中不同阶段,其中TLR4信号通路在Ad5-PA免疫后的GC反应中发挥着重要作用。Ramos细胞中STAT3被抑制后Bcl6的表达下调,说明Ad5-PA免疫后GC B中Bcl6的表达可能受到STAT3的调节。分别用腺病毒的结构蛋白Fiber和Hexon对小鼠进行免疫发现,Hexon能够更加有效地刺激树突状细胞表面TLR4的表达。同时发现由Ad5-PA刺激产生的TLR4上调效应能够被HMGB1抗体所中和,这提示在Ad5-PA免疫中HMGB1可能作为TLR4的内源性配体和Hexon一起诱导TLR4下游通路的级联反应。我们用含有TLR4的配体MPLA以及能够增强抗原递呈效果的Addvax或Alum组成复合佐剂系统和抗原PA共同免疫小鼠,能够促进PA特异性抗体的快速产生,达到与Ad5-PA相似的效果,进一步明确了同时增强APC的递呈及激活TLR4信号通路能够更有效地增强抗原特异性体液免疫应答。综上所述,本研究发现TLR信号通路在腺病毒载体疫苗抗体生成的两个关键步骤:抗原递呈和生发中心反应中都发挥了重要作用,其中TLR4的影响最大,证明了激活完整的免疫应答过程对于增强疫苗的免疫效果有着重要意义,为今后应急疫苗的理性设计提供了依据。本研究还发现Ad5-PA对TLR4的激活可能取决于Hexon蛋白,并且是以一种依赖于HMGB1的方式,含有TLR4配体的颗粒型佐剂系统能够增强抗原的免疫效果,刺激抗体的快速产生,为设计新型疫苗提供了思路。