本文分为两部分。第一部分是成年大鼠脊髓全横断断端间隙内植入纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)包裹的嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)后细胞存活迁移及轴突再生的形态学观察，第二部分是对成年猴脊髓半切后运动功能新的电生理检测指标的探索。 成年哺乳动物脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)再生所面临的困难主要来自两方面：(1)神经再生抑制因素的存在：少突胶质细胞产生的对轴突再生具有强烈抑制作用的髓鞘抑制蛋白，损伤后星型胶质细胞在局部形成的致密胶质瘢痕及其细胞外基质中充斥的抑制轴突再生硫酸软骨素(chondroitin-sulfate containing proteoglycan，CSPG)。(2)神经再生促进因素的缺乏：多种维持损伤神经元的存活、促进并导引发芽的轴突再生至靶区多种神经营养因子、细胞外基质成分和细胞粘附分子的缺乏。 促进SCI轴突再生与功能恢复的研究中，OECs移植目前被认为是最有前景的方法之一，并且具有重要临床应用价值。OECs是嗅觉系统的胶质细胞，一方面能够分泌多种神经营养因子、细胞基质成份和细胞粘连分子，为轴突再生提供合适的微环境，另一方面可以与中 第四军医大学博士学位论文 一 枢神经系统（central nervous system，CNS）自然整合，形成细胞索支 架，伴随并包裹再生轴突，使其避免与中枢再生抑制因素接触，并越 过胶质瘫痕，引导轴突再生至特定的靶细胞形成突触，从而实现功能 的重建。近年来不断有研究成功运用OECs的移植促进损伤的脊髓轴 突再生，并在脊髓全横断模型中取得了部分运动功能的恢复。 但是直接移植干脊髓全横断断端间隙的OECS悬液与脊髓断面接 触不佳，难以迁移进入脊髓实质内，不能建立起桥梁，无法发挥作用。 将OECs悬液植入脊髓断端实质内，虽可促进脊髓受损神经再生并获 得一定的功能恢复，但对脊髓造成了额外损伤，注射局部明显肿胀， 加重空洞的形成，并迫使再生的皮质脊髓束移行于损伤节段的外表 面，从而限制了功能的更好恢复。 另外，作为移植材料的OECs的活性和纯度和全横断脊髓两断端 的良好对接，也是直接关系到SCI轴突再生与进一步功能恢复的重要 因素。 本研究探索了简便、快捷的培养纯化方法，为移植提供了活性好、 纯度高、数量大的OECs，以FG包裹OECs移植于脊髓断端间隙内， 不仅促进了脊髓两断端的良好对接，而且使得OECS在间隙内与脊髓 断面保持良好接触，存活并迁移进入脊髓断端实质内，形成细胞索支 架，发挥促进轴突再生的作用。 首先，培养来自成年大鼠嗅球嗅神经层及嗅颗粒层的OECs，以 Arc（和差速贴壁处理纯化，得到纯度大于95％的OECS，继续培养 数日，待细胞恢复活力、增殖旺盛且尚未老化时用于移植。通过对不 同培养时间的细胞活性进行检测发现，纯化后继续培养420 日的细 胞活性好、纯度高，适于移植。这一方法不仅确保了OECs的活性、 纯度和数量，而且大大简化了培养和纯化过程，缩短了整个培养时间， 利于细胞生物学性状的保持，为成功移植奠定了良好基础。 一2一 第四军医大学博士学位论文一 其次，FG通常是用来粘和创口和局部止血的，曾作为粘着因子应用于CNS，具有良好的生物相容性。不仅如此，网格结构的FG还具有可降解、孔径可调节等多种优良特性，又是生物体内的天然成分，因此本实验将FG应用于大鼠脊髓全横断断端间隙内，观察FG除了作为粘着因子外，可否作为一种天然支架材料，促进脊髓两断端的对接。观察术后不同时间点脊髓两断端的对接情况，发现与断端间隙应用细胞培养液 DF或断端间隙未做任何处理的动物相比，局部应用了FG的动物脊髓两断端的对接情况显著改善，并且有效地减少了脊髓全横断术后两断端完全不连的发生。这说明FG可以作为一种天然支架材料促进脊髓两断端连接，并且提示FG有可能成为细胞或其它物质在断端间隙内移植的良好载体。 进一步利用FG的特性，将培养纯化的OECs包裹于FG中移植于脊髓断端间隙内，结果观察到FG的存在将OECs存留于断端间隙中，与脊髓断面形成良好接触，进而迁移进入实质内，形成细胞索支架，在不对脊髓造成额外损伤的情况下发挥OECs促进轴突再生的作用。同时FG还促进了断端的对接。一定程度上屏蔽了损伤局部不利于轴突再生的物质，这些都为进?