薯蓣属植物中的主要活性成分是甾体皂苷,但天然的甾体皂苷常常以低活性的多糖基形式存在,不易被人体吸收。为制备高活性的、易吸收的低糖基甾体皂苷,本文采用微生物酶法转化穿龙薯蓣中的甾体皂苷,并研究了其特异性的甾体皂苷糖苷酶的分离纯化、酶性质以及基因的克隆和表达。本研究首先采用乙醇浸提法对穿龙薯蓣植物中总皂苷进行提取,并对提取物进行脱脂、脱糖处理。从4kg穿龙薯蓣植物干燥根中共提取得到了250g的总皂苷,得率为6.3%。通过硅胶柱层析法和制备色谱法,从总皂苷中分离纯化得到了两种主要甾体皂苷,结构经鉴定分别为：26-0-p-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-/△5(6)-烯-3β,26-二羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(原薯蓣皂苷),薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(薯蓣皂苷)。研究了甾体皂苷酶的生产菌,筛选获得了转化穿龙薯蓣总皂苷效果较好的米曲霉(DLFCC-38),其粗酶液几乎完全转化穿龙薯蓣总皂苷,主要生成薯蓣次皂苷A、纤细皂苷,以及一定量的薯蓣皂苷元。以薯蓣次皂苷A的产量为目标,对微生物发酵产酶的条件进行了优化,最佳条件为：最佳诱导物为穿龙薯蓣提取物,最佳诱导物浓度为2%(v/v),在30℃条件下发酵72h。其次,对酶转化的反应条件进行了优化,最佳酶反应条件为：反应温度为50℃,反应体系pH5.0,反应时间9h,反应体系中底物最终浓度20mg/ml。在此基础之上,米曲霉(DLFCC-38)大量发酵制备粗酶液,批量定向酶解制备低糖基甾体皂苷。总皂苷160g经酶转化后共制备得到产物粗品117g,产物经硅胶柱层析法分离纯化,得到3种单体皂苷成分,分别为：60.3g的薯蓣次皂苷A,得率为51.5%；纤细皂苷11.54g,得率为9.86%；3.01g的薯蓣皂苷元,得率为2.57%。采用分子筛层析法和离子交换层析法,对米曲霉(DLFCC-38)诱导产粗酶液进行分离纯化。经三次柱法层析,分离得到了原薯蓣皂苷糖苷酶的纯酶。经SDS-PAGE法测定,该酶的分子量约为55kDa。酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0,酶活力在60℃以下,pH为3.0-8.0范围内相对稳定。K+、Na+、Mg2+、Ca2+四种金属离子对酶活力几乎没有影响；Zn2+对酶活力具有一定的抑制作用；而低浓度的Cu2+和Fe3+对酶活力都有明显的抑制作用。纯化得到的原薯蓣甾体皂苷糖苷酶,能水解原薯蓣皂苷上的26-O-β-D-葡萄糖基生成薯蓣皂苷,然后进一步水解薯蓣皂苷的3-O-α-L-(1→4)-鼠李糖基生成薯蓣次皂苷A。该酶水解原薯蓣皂苷葡萄糖基的Km=4.59mM,Vmax=3.86mM/h,水解薯蓣皂苷鼠李糖基的Km=42.6mM,Vmax=0.15mM/h。此外,该酶还能水解对硝基苯基-α-D-半乳糖苷(pNP-α-D-Ga1)、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNP-β-D-Glc)和对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNP-β-D-Gal)。该酶呈现出新的水解特性,不同于国际酶学委员会公布的184种糖苷酶(一种糖苷酶只能水解一种糖苷键),也不同于其他已报道过的甾体皂苷糖苷酶,是一种新酶,将其命名为原薯蓣皂苷糖苷酶-1型(protodioscin-Glycosidase-1, PGase-1)。采用RT-PCR技术以及RACE技术,对原薯蓣皂苷酶-1型的基因全长序列进行调取。该酶基因全长为1725bp,包含一个1497bp的开放阅读框(ORF),编码498个氨基酸,N端前20个氨基酸序列为信号肽序列。通过亚克隆技术,将原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因重组至真核表达载体pPIC9K,并电转化至巴斯德毕赤酵母GS115。重组酵母菌诱导表达的酶液具有原薯蓣皂苷糖苷酶-1型的酶活力,且最佳诱导培养时间为144h、甲醇的最终浓度为0.5%。经SDS-PAGE分析,诱导表达酶的分子量约为55kDa,与野生型原薯蓣皂苷糖苷酶-1型的分子量55kDa相近。这说明原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因在毕赤酵母中成功的进行了异源表达。经序列相似性比较,发现原薯蓣皂苷糖苷酶-1型的基因与α-淀粉酶的基因序列有很高的相似性。基于两者序列的相似性,原薯蓣皂苷糖苷酶-1型应分在糖苷水解酶家族GH13(Glycoside Hydrolase Family13)中；但是两者具有完全不同的水解特性。因此,酶蛋白的基因序列不能完全代表酶的特性。