华法林(Wafarin)是一种常用的香豆素类抗凝剂，主要用于预防及治疗深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞后血栓栓塞并发症以及房颤、心瓣膜疾病或人工瓣膜置换术后引起的血栓栓塞并发症等。人工机械瓣膜置换术患者必须进行终身抗凝治疗，以防止血栓栓塞发生，但是常用的抗凝药华法林治疗窗窄，容易导致出血等不良反应。目前主要靠监测患者的国际标准化比值(INR)来调整用药剂量。随着遗传药理学的发展，人们发现编码华法林代谢和药效的酶的基因存在遗传多态性，而且在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异。以遗传药理为基础的药物剂量调整得到各方面的重视，美国FDA近期修改说明书建议华法林在用药前应做相关基因型检测。 华法林有两种构象：R和S。其中S—华法林的作用占60-70％，而R—华法林只有30-40％。S—华法林主要由CYP2C9代谢生成无活性的代谢产物。CYP2C9的基因多态性与华法林剂量间的关系早已被证实。亚洲人CYP2C9的突变频率较低，常见的突变型为CYP2C9*3。CYP2C9*3突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5％，而另一在高加索人群中较常见的突变型CYP2C9*2的活性为野生型的12％。这两种突变均降低了酶活性使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此，需降低用药剂量，防止不良反应的发生。 维生素K环氧化物还原酶(vitaminKepoxidereductase，VKOR)是华法林作用的靶点，也是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，编码该酶的基因位于人类染色体16p12-q21。目前已有一系列VKORC1的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)与华法林剂量的相关性报道。例如位于启动子E—Box(CANNTG)中第二个核苷酸的单核苷酸多态性VKORC13673G>A会改变E—Box共义序列，从而改变启动子活性，最终影响华法林剂量。其中，VKORC13673GG剂量较高，而GA，AA剂量依次降低。VKORC1基因多态性是影响华法林用药剂量个体差异和种族差异的主要因素。 CYP4F2是新发现的与华法林剂量相关的遗传因素。CYP4F2与华法林剂量的相关性首先由Caldwell等人报道，CYP4F2rs2108622可以解释2％的华法林剂量，CYP4F2rs2108622TT基因型患者的剂量比CC基因型患者高1mg/day。McDonald等应用重组细胞色素P450酶，及人肝微粒体研究证实CYP4F2为维生素K的单氧酶，可氧化底物生成ω—羟基衍生物。而且不同基因型的人肝微粒显示出不同的维生素K代谢活性：CC基因型肝微粒体代谢活性最高，TT基因型肝微粒体代谢活性最低，为CC基因型的75％，CT基因型介于两者之间。也就是说CYP4F2rs2108622突变减少了维生素K的代谢，使维生素K浓度升高。为了抑制维生素K的还原，达到相同的抗凝效果，CYP4F2rs2108622突变型患者需要提高华法林剂量。这些研究的人群主要为高加索人，目前尚无中国人群的报道。 本文首先用PCR—RFLP技术研究CYP2C9，VKORC1和CYP4F2基因多态性在中国汉族人工机械瓣膜置换术患者中的分布情况。并与文献报道的中国汉族健康人及不同种族的相关基因型频率进行对比。在此基础上，我们采用回顾性研究的方法，对人工机械瓣膜置换术患者的CYP2C9、VKORC1和CYP4F2基因多态性与其华法林稳定剂量进行相关性研究，并运用多重回归方法建立华法林剂量方程，以期探讨人工机械瓣膜置换术患者的CYP2C9、VKORC1和CYP4F2基因多态性对华法林稳定剂量的影响，并为制定合理的华法林用药方案提供依据。 第一部分CYP2C9、VKORC1和CYP4F2基因型研究 目的： 研究中国汉族人工机械瓣膜置换术患者CYP2C9、VKORC1和CYP4F2基因多态性，与中国汉族健康人群及其他种族进行比较，明确这些基因型在中国汉族人工机械瓣膜置换术患者人群中的分布特点。 方法： 用PCR—RFLP的方法检测中国汉族人工机械瓣膜置换术患者CYP2C9*3、VKORC13673G>A、VKORC19041G>A和CYP4F2rs2108622的基因型，计算基因型频率，等位基因频率，验证是否符合Hardy—Weinberg平衡。用x2检验的统计学方法对文献报道的中国汉族健康人群及各种族基因频率进行分析，比较分布差异。 结果： (1)中国汉族人工机械瓣膜置换术患者CYP2C9*3、VKORC13673G>A、VKORC19041G>A和CYP4F2rs2108622基因频率分布符合Hardy—Weinberg平衡。CYP2C9*3频率4.5％；VKORC13673A频率为86％。VKORC19041A频率为14％。CYP4F2rs2108622T突变频率为27％。在本研究人群中，无VKORC15417G>A突变出现。 (2)患者中最常见VKORC13673-9041单倍型为A—G，发生频率为85.1％，预测人群中的频率为84.8％。其次常见为G—A单倍型发生频率为13.3％，预测人群中的频率为13.5％。 (3)人工机械瓣膜置换术后患者的CYP2C9，CYP4F2基因频率与健康人比无统计学差异。VKORC13673G>A基因型与文献报道的汉族健康人的分布情况有统计学差异。 (4)在与不同种族CYP2C9，VKORC13673G>A，VKORC19041G>A和CYP4F2rs2108622发生频率比较中，本研究人群的VKORC13673G>A发生频率与其他东亚洲人种相似，而与高加索人，非洲人差异显著。CYP2C9等位基因频率除与亚洲人相似外，还与非洲人接近。CYP4F2rs2108622发生频率仅与非洲人有统计学差异。 结论： 本研究人群CYP2C9突变频率较低与东亚人群相似。而VKORC1突变频率与属于华法林高剂量人群的高加索人，非洲人差异显著，体现中国人属于低剂量人群的基因型分布特征。除非洲人群外，各种族CYP4F2rs2108622突变频率无差异。 第二部分CYP2C9、VKORC1和CYP4F2基因型及单倍型与机械瓣膜置换术患者华法林稳定剂量的相关性研究 目的： 旨在研究CYP2C9、VKORC1和CYP4F2等基因多态性及VKORC1单倍型以及患者临床特征对华法林剂量的影响，为以后利用基因多态性指导临床合理用药打下理论基础。 方法： 用PCR—RFLP方法及测序方法检测CYP2C9、VKORC1和CYP4F2等基因的基因型。采用回顾性研究方法，分析基因型及单倍型以及临床特征与华法林稳定剂量的相关性。 结论： 首次证实了中国人群中CYP4F2基因多态性与华法林剂量的相关性。CYP2C9、VKORC1和CYP4F2等基因型，以及年龄、BSA、联合使用胺碘酮等都是影响华法林稳定剂量的重要因素。 第三部分华法林稳定剂量预测方程的建立与验证 目的： 以CYP2C9、VKORC1和CYP4F2为基础，建立华法林稳定剂量预测方程，为下一步指导华法林合理用药奠定基础。 方法： 本部分研究在第2部分相关性研究的基础上，进一步利用有意义的因素，运用多重回归方法建立华法林剂量预测方程，并以独立人群对方程进行验证。 结论： 本研究根据单因素分析的结果，利用多重回归的统计手段总结出了包含CYP2C9、VKORC13673G>A和CYP4F2rs2108622等基因型以及年龄、BSA和药物相互作用在内的人工机械瓣膜置换术后患者华法林稳定剂量的计算公式。在多重回归中CYP4F2的作用依然明显，再次证实了它对华法林剂量的作用。通过方程的验证，证实了方程的作用，且与传统用药方案相比能够更准确反映患者的实际剂量。该方程有待在日后前瞻性研究中继续完善。