论文部分内容阅读
目的:关节软骨是一种非自我修复的组织,软骨损伤是全世界范围内的一种多发常见的健康疾病。临床表现为活动功能障碍、关节疼痛,严重时会造成骨性关节炎的发生。目前临床上对于软骨损伤尚无治愈方法,只能采取药物镇痛、理疗、手术、软骨细胞及组织移植和关节置换等,减少损伤造成的影响,短期缓解症状。因而,迫切需要有效的治疗策略进行修复治疗。间充质干细胞是一种能够自我更新的多能干细胞,可分化为多种细胞系,如成骨细胞和软骨细胞等。有研究表明,间充质干细胞能够促进关节软骨的修复和再生。相对于其他来源的干细胞,脂肪间充质干细胞分离相对容易、产量高、增殖和分化潜力大的特点,在生物医学领域得到了广泛应用。细胞外囊泡(EVs)由多种细胞释放,可作为细胞间通讯的工具。EVs可以选择蛋白质分子、基因(RNA和DNA)和细胞因子等功能性生物活性物质,并将其传递到细胞外环境或其他靶细胞。由于间充质干细胞来源的EVs能够携带特殊的生物活性物质且保留间充质干细胞的特征而被认为是无细胞再生医学的重要组成部分。壳寡糖是一种天然多糖,可生物降解,具备优良的生物相容性和无毒特性,在生物医学领域,如组织工程,和药物制备等方面得到了广泛的应用。有研究表明,壳寡糖能够促进成骨细胞分化和新骨形成/成熟,促进骨髓间充质干细胞的增殖并向软骨细胞分化。本研究旨在探讨脂肪间充质干细胞来源的EVs偶联壳寡糖形成的EVs-壳寡糖结合物在软骨细胞损伤修复中的作用,为软骨损伤的治疗提供新的证据,也为EVs的临床应用奠定基础。研究方法:1、本研究从大鼠软骨组织中分离出原代软骨细胞,并使用免疫组化检测细胞中II型胶原蛋白的表达;从大鼠脂肪间充质干细胞中提取EVs,并使用透射电子显微镜观察形态学特征,纳米颗粒跟踪分析粒径大小,western blot检测CD63、TSG101、CD9和Calnexin的表达;将不同浓度的EVs或壳寡糖加入大鼠软骨细胞中培养48 h,并使用CCK-8实验检测细胞活力来筛选最优浓度;将壳寡糖与EVs偶联得到EVs-壳寡糖结合物,并使用透射电子显微镜观察形态学特征,纳米颗粒跟踪分析粒径大小;使用PKH-67标记EVs和EVs-壳寡糖结合物,将其分别与大鼠软骨细胞共培养,并通过倒置荧光显微镜观察软骨细胞中的分布。2、采用IL-1β建立软骨细胞损伤模型,然后加入壳寡糖、EVs和EVs-壳寡糖结合物,通过CCK-8实验检测细胞增殖,通过流式细胞术检测细胞凋亡,通过Transwell和划痕实验检测细胞迁移,还通过qRT-PCR和western blot实验检测软骨细胞特异性基因(COL1A1和COL2A1)、成骨相关基因(OCN、OPN和RUNX2)、凋亡相关基因(c-Myc、p53和Bcl2)和PI3K/Akt通路表达情况。3、构建大鼠全层软骨缺损模型,然后关节腔注射壳寡糖、EVs和EVs-壳寡糖结合物进行治疗处理,通过HE染色和ABH&E染色观察大鼠软骨组织的组织学变化,通过免疫组化检测COL1A1和COL2A1表达情况。4、通过转录组测序筛选壳寡糖组、EVs组和EVs-壳寡糖结合物组在软骨损伤模型治疗中的基因表达谱,并对差异表达基因进行GO注释和KEGG路径富集分析;通过qRT-PCR和western blot实验在体内外模型中进一步验证差异表达基因的表达情况。结果:1、免疫组化结果显示,提取大鼠软骨细胞中II型胶原蛋白的表达为阳性。透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和western blot实验结果显示,脂肪间充质干细胞来源的EVs呈杯状或近圆形,大小约133.9 nm,阳性表达CD63、TSG101和CD9,阴性表达Calnexin,以上结果均符合EVs的特征。壳寡糖浓度在320μg/ml时软骨细胞活力最高,EVs浓度在20μg/ml时软骨细胞活力最高,选择此浓度将壳寡糖与EVs偶联得到EVs-壳寡糖结合物。透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析显示,EVs-壳寡糖结合物呈杯状或近圆形,大小约183.4 nm。倒置荧光显微镜观察到EVs和EVs-壳寡糖结合物能够被大鼠软骨细胞摄取。2、CCK-8、流式细胞术、Transwell和划痕实验结果显示,EVs、壳寡糖和EVs-壳寡糖结合物促进软骨细胞增殖、迁移,抑制软骨细胞凋亡,且EVs-壳寡糖结合物的作用优于壳寡糖。qRT-PCR和western blot实验结果显示,EVs、壳寡糖和EVs-壳寡糖结合物调节软骨细胞特异性基因(COL1A1和COL2A1)、成骨相关基因(OCN、OPN和RUNX2)、凋亡相关基因(c-Myc、p53和Bcl2)和PI3K/Akt通路,且EVs-壳寡糖结合物的作用优于壳寡糖。3、HE和ABH&E染色结果均显示,EVs、壳寡糖和EVs-壳寡糖结合物促进软骨细胞损伤修复,且EVs-壳寡糖结合物的修复作用优于壳寡糖。免疫组化结果显示,EVs、壳寡糖和EVs-壳寡糖结合物增加COL1A1和COL2A1蛋白表达,且EVs-壳寡糖结合物的作用优于壳寡糖。4、在体内模型中,测序结果显示壳寡糖组和模型组之间存在2091个差异表达基因;EVs-壳寡糖结合物组和模型组之间存在503个差异表达基因;壳寡糖组和EVs-壳寡糖结合物组之间存在412个差异表达基因。EVs-壳寡糖结合物调节PI3K/Akt信号通路(COL1A1、COL3A1、TGA4、BAD和FOXO3)、Wnt信号通路(SFRP5、SOX9和GLI1)、AMPK信号通路(PPP2R3A、CPT1B和ACACB)和MAPK信号通路(CACNA1S、CACNG1和MAPK1)。qRT-PCR/western blot的结果与测序结果一致性为80%,证实了测序结果的可靠性较高,且筛选出5个差异表达最大的基因Vps13a、Itga1、Birc6、Ifi27l2b和Gli1。结论:1、壳寡糖与EVs偶联形成EVs-壳寡糖结合物能够被大鼠软骨细胞摄取。2、在体外损伤模型中,EVs-壳寡糖结合物促进软骨细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡,调控软骨细胞特异性基因(COL1A1和COL2A1)、成骨相关基因(OCN、OPN和RUNX2)、凋亡相关基因(c-Myc、p53和Bcl2)和PI3K/Akt通路。3、在体内模型中,EVs-壳寡糖结合物促进软骨细胞损伤修复,增加COL1A1和COL2A1蛋白表达。4、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路和MAPK信号通路的负调控可能与软骨损伤修复相关。Vps13a、Itga1、Birc6、Ifi27l2b和Gli可能是EVs-壳寡糖结合物促进软骨损伤修复的潜在靶点。我们的研究结果揭示了EVs-壳寡糖结合物对软骨细胞损伤修复的影响和机制,为其作为一种新型潜在药物,治疗软骨损伤和损伤性骨关节炎奠定了基础。