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研究背景及目的:大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。大肠癌的治疗是以手术为主,并辅以化疗和其他支持疗法的综合治疗。大肠癌根治术后辅助化疗可以降低肿瘤细胞的活性,控制、减少微小转移灶;而术前新辅助化疗可以不同程度的减轻肿瘤负荷,使临床分期降低。因此,化疗是大肠癌除手术之外最主要的治疗方法。尽管化疗可以有效杀灭癌细胞,但有研究表明化疗还具有增加肿瘤细胞恶性表型的不良作用,化疗后的肿瘤细胞显示出更强的侵袭性。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程,它以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征。目前已发现EMT存在于多种上皮来源的恶性肿瘤中,与肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移密切相关。本研究分别通过体内及体外实验验证化疗药物与大肠癌细胞发生EMT之间的关系,为进一步研究大肠癌发生EMT过程中的分子机制提供支持。细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)是一种新近被认识、存在于细胞内的正常形式朊蛋白。在前期实验中,同实验组成员发现PRNP(编码PrPc的基因)是大肠癌细胞发生EMT前后表达改变最明显的基因(约21.4倍),因此在本研究中,通过体内外实验分别验证PrPc在大肠癌细胞发生EMT的过程中是否起到了关键性的作用。信号转导与转录活化因子(Signal transducers and activators of transcription3,STAT3)及转录因子Snail是众多细胞因子和生长因子受体信号的下游效应物,STAT3-Snail通路的活化与多种肿瘤细胞的EMT发生有关。而本研究通过一些列实验验证STAT3-Snail是否参与了大肠癌细胞发生EMT的过程以及是否起到了关键性的作用。研究方法:1.收集大肠癌患者行肠镜活检和新辅助化疗(FOLFOX方案)后手术切除齐全配对的存档蜡块标本。采用免疫组化的方法检测新辅助化疗前后标本发生EMT的情况以及发生EMT的标本中PrPc的表达情况。2.采用χ2及t检验检测体内标本发生EMT是否与患者年龄、病理类型等因素有关。3.使用化疗药物5-fu或奥沙利铂(oxp)处理大肠癌细胞株dld-1或ht29以构建大肠癌细胞emt模型。4.采用倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、免疫印迹(westernblot)、体外侵袭实验观察检测细胞是否发生emt以及细胞内stat3、细胞因子的变化情况。5.体外转染prpcsirna或真核表达质粒pcdna3.0-prnp或sisnail至大肠癌dld-1细胞(以空载转染细胞为阴性对照)以干扰或促进癌细胞内prpc、snail的表达。6.委托上海卓康生物有限公司采用pull-down技术检测大肠癌dld-1细胞发生emt后与prpc相结合的蛋白。7.采用免疫共沉淀方法检测大肠癌dld-1细胞发生emt后stat3与prpc的结合情况。8.构建e-cadherin基因启动子、紧密连接膜蛋白occluding基因启动子和雌激素合成酶芳香化酶(estrogensynthetaseenzymearomatase)基因启动子的荧光素酶报告基因并转染dld-1细胞,观察启动子活性的变化情况。结果:1.免疫组化方法检测临床组织标本发现化疗后的大肠癌细胞发生了emt且发生emt的标本中prpc的表达量有显著增高。2.新辅助化疗后大肠癌细胞是否发生emt与癌组织微血管浸润及肿瘤细胞分化水平相关(p<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤病理类型无关(p>0.05)。3.体外实验发现,经化疗药物处理后的大肠癌细胞,细胞形态发生了间质化的改变;上皮标记物表达水平降低而间质标记物表达水平明显升高;细胞骨架肌动蛋白f-actin发生重排;细胞体外侵袭能力增强,表明细胞发生了emt。4.体外转染prpcsirna干扰细胞内prpc的表达可以显著抑制5-fu诱导的emt以及抑制体外侵袭转移力增强等效应。5.体外转染真核表达质粒pcdna3.0-prnp使癌细胞内直接表达prpc可以使大肠癌细胞发生emt。6.采用pull-down检测出5-fu作用后的dld-1细胞中与prpc结合力最强的蛋白是stat3(92kda)。7.5-fu作用dld-1细胞12小时后,采用免疫共沉淀技术检测发现,诱导表达的prpc蛋白即可与stat3相互结合,并伴随stat3关键活性位点tyr705和ser727磷酸化水平的提高。8.使用pcdna3.0-prnp转染dld-1细胞后,使用westernblot方法检测发现Snail被诱导表达,但这种诱导作用能被AZD9150(PrPc-STAT3通路抑制剂)明显抑制。同时,其他EMT转录因子的表达水平则无明显变化,未受这两种处理因素影响。9.通过荧光素酶报告基因检测,PrPc可以抑制上述三种启动子活性,该抑制过程可被AZD9150、siSnail两种处理因素所抑制。10.抑制PrPc表达能引起5-FU作用后的DLD-1细胞核内Snail几乎完全消失。而在对照组细胞中,过表达PrPc能促进细胞浆内Snail向细胞核内移位。11.转染pCDNA3.0-PRNP至DLD-1细胞12小时后,就能引起较明显的Snail表达和Snail磷酸化。结论:体内外实验均表明化疗药物可以诱导大肠癌细胞发生EMT。大肠癌细胞在化疗药物作用下的上皮-间质转化过程依赖于PrPc蛋白的功能。PrPc通过下游STAT3通路在化疗药物诱导大肠癌细胞发生EMT的过程中发挥作用。PrPc-STAT3信号通路在大肠癌发生EMT过程中,通过调控Snail磷酸化来影响E-cadherin等基因的表达,继而在EMT过程中发挥主要作用。