论文部分内容阅读
目的：此文研究人通用转录因子IIF多肽2蛋白(GTFIIF2蛋白)与胞内氯离子通道1蛋白(CLIC1蛋白)的相互作用,构建质粒 pCDNA3.1-FLAG-GTFIIF2、pCDGFP-GTFIIF2和pGEX-5X-3-GTFIIF2,瞬时转染或转化到细胞中,通过免疫荧光、GST pulldown、免疫共沉淀等实验技术来研究 GTFIIF2蛋白与CLIC1蛋白在体外和哺乳动物细胞中的共定位和相互作用情况。 方法：以GTFIIF2的全长cDNA序列为模板,设计GTFIIF2的上下游引物,利用聚合酶链式反应技术扩增出GTFIIF2序列,构建到pCDNA3.1(+)真核表达载体和GEX-5X-3原核表达载体中,用双酶切鉴定并将正确的pCDNA3.1-FLAG-GTFIIF2、pCDGFP-GTFIIF2及 pGEX-5X-3-GTFIIF2重组质粒送生物公司检测序列,经过BLAST比对,然后将测序正确的pCDNA3.1-FLAG-GTFIIF2或 pCDGFP-GTFIIF2分别转染到COS7细胞,观察GTFIIF2在细胞内的表达及分布情况;再将GTFIIF2与CLIC1的真核表达质粒共转染到COS7细胞,观察GTFIIF2与CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况;将构建正确的pGEX-5X-3-GTFIIF2转化到BL21感受态细胞中,制备融合蛋白pGEX-5X-3-GTFIIF2,同时转染pCDGFP-CLIC1到HEK-293T细胞,通过GST pulldown技术检测两者在体外相互作用情况;转染 pCDNA3.1-FLAG-GTFIIF2到HEK-293T细胞,利用免疫印记方法检测蛋白表达情况,并与pCDGFP-CLIC1共转染到 HEK-293T细胞,用免疫共沉淀技术初步验证两者在哺乳动物细胞内是否存在相互作用。 结果：酶切鉴定与测序的结果表明重组质粒 pCDNA3.1-FLAG-GTFIIF2、pCDGFP-GTFIIF2与pGEX-5X-3-GTFIIF2构建正确。荧光显微镜检测GTFIIF2蛋白主要分布在COS7细胞的细胞核内,在细胞质中未见表达,CLIC1蛋白在细胞核和细胞质都有分布,并且两者在COS7细胞中存在重叠分布,说明存在共定位。通过摸索浓度、温度和时间等条件,用IPTG诱导,pGEX-5X-3-GTFIIF2融合蛋白表达成功,GST pulldown技术验证了体外条件下GTFIIF2蛋白能够把CLIC1蛋白沉淀下来;再经过Western blot法检测到GTFIIF2蛋白在HEK-239T细胞中表达。免疫共沉淀实验证明带FLAG标签的GTFIIF2蛋白可以把CLIC1蛋白沉淀下来。 结论：通过免疫荧光、GST pulldown和免疫共沉淀等实验,初步验证了GTFIIF2蛋白与CLIC1蛋白在体外和细胞内存在相互作用。