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脂肪酶是类脂化合物分解、合成和酯交换反应的重要催化剂，具有高度的立体和区域选择性，在有机催化领域应用广泛。近年来，利用脂肪酶制备高光学纯度手性化合物的研究日益成为国内外关注的热点。然而，脂肪酶在有机溶剂中不稳定，容易失活。因此开发天然耐有机溶剂脂肪酶在理论和工业应用方面具有重要的意义。本论文筛选获得了天然耐有机溶剂脂肪酶产生菌;优化了该菌株的发酵产酶条件;纯化了该脂肪酶;研究了其酶学性质;研究了该脂肪酶手性拆分1-苯乙醇和扁桃酸的性能并运用分子模拟方法解析了其高立体选择性的拆分机理。本文的主要研究成果如下: (1)耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选:以20％甲苯等有机溶剂作为筛选压力，从土壤样品中筛选获得耐有机溶剂极端微生物123株，建立了相应菌库，经产脂肪酶能力初筛和有机溶剂耐受性复筛，得到菌株LC2-8，其脂肪酶产酶能力达153.3U/mL。脂肪酶LC2-8粗酶液在各种有机溶剂中活力和稳定性均有显著提高。该新型耐有机溶剂脂肪酶高产菌株被鉴定为Pseudomonas stutzeri，命名其为Pseudomonas stutzeri LC2-8(简称LC2-8)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO:M2010279。 (2)产脂肪酶发酵条件优化:优化的P.stutzeri LC2-8产脂肪酶发酵培养基组成为:葡萄糖8g/L，玉米浆15mL/L，酵母粉5g/L，尿素10g/L，K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，玉米油5mL/L，Triton X-1000.5mL/L，pH8.0。优化的发酵培养条件为:摇床转速180 r/min，250mL三角瓶中装液量40mL，接种量2.0％，温度30℃，发酵56h。优化发酵获得脂肪酶活力达352.9U/mL，为初始最高酶活的2.3倍，显著高于已报道的耐有机溶剂脂肪酶野生菌的产酶能力。 (3)脂肪酶LC2-8的分离纯化:采用丙酮沉淀和DEAE-Sepharose FF离子交换层析两步纯化得到电泳纯的脂肪酶LC2-8。其比活力为4760 U/mg，纯化倍数为21.2倍，酶活回收率为32.8％。该脂肪酶的表观分子量为32 kDa。根据LC-MS/MS测序结果，克隆获得了脂肪酶LC2-8的基因序列（全长936bp，编码311个氨基酸）。序列比对结果表明，脂肪酶LC2-8与来源于基因组测序的P.stutzeri A1501脂肪酶Lip C和P.mendocina PK-12CS脂肪酶lip A的氨基酸序列同源性分别为96％和95.5％，与其他已报道酶学性质研究的脂肪酶的氨基酸同源性均低于80％，显示其为新型耐有机溶剂脂肪酶。 (4)脂肪酶LC2-8的酶学性质研究:该脂肪酶的最适反应pH为8.0，在较宽的pH范围内(6.0～10.0)具有较高的稳定性。其最适反应温度为30℃。在25％（体积分数）的各种有机溶剂体系中，脂肪酶LC2-8表现出较好的溶剂耐受性。大多数的亲水性有机溶剂对脂肪酶LC2-8具有激活作用。在正庚烷、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇和DMSO体系中该脂肪酶的半衰期提高了10倍以上。 (5)脂肪酶LC2-8转酯拆分1-苯乙醇优化的反应条件为:正己烷溶剂体系，1-苯乙醇200 mmol/L，酰基供体乙酸乙烯酯与1-苯乙醇摩尔浓度比为4∶1，脂肪酶酶粉添加量为10 mg/mL，反应温度30℃，搅拌转速180 r/min，反应时间24 h，该反应转化率达52.4％，剩余底物均为S-1-苯乙醇，底物对映体过量值ees为99.9％。 (6)脂肪酶LC2-8转酯拆分扁桃酸优化的反应条件为:异丙醚溶剂体系，扁桃酸180 mmol/L，酰基供体乙酸乙烯酯与扁桃酸的摩尔浓度比为1∶8，脂肪酶酶粉添加量为20 mg/mL，反应温度35℃，搅拌转速180 r/min，反应时间15h，转化生成S-乙酰氧基扁桃酸，转化率为49.2％，产物对映体过量值eep为99.8％，残余底物R-扁桃酸的底物对映体过量值ees为96.5％。结果表明脂肪酶LC2-8对扁桃酸具有较严格的S-型对映体选择性，反应体系中的扁桃酸浓度达180mmol/L(55g/L)，显著高于现有国内外的相关报道。 (7)脂肪酶高选择性拆分扁桃酸的机理解析:以Pseudomonas aeruginosa脂肪酶(1EX9_A)为模板建立脂肪酶LC2-8的三维结构模型;运用Discovery Studio2.5软件构建乙酰酶复合物;分子对接结果显示酶-S型底物复合物中的dO-C和dH-N均小于4(A)，能够形成有效的S型扁桃酸的中间态复合物;而酶-R型底物复合物中的dO-C和dH-N均大于4(A)，R型扁桃酸的α羟基难以对催化残基产生有效进攻。此外，酶-S型底物复合物的总能量低于酶-R型底物复合物。明确阐明了脂肪酶LC2-8以较大优势优先选择催化S-扁桃酸的分子机理。