一、背景肺癌作为一种恶性肿瘤,实际的发病以及死亡率在全球范围中都位列榜首之位,已经严重危害人类的生命质量及健康,且在近些年呈逐年上升趋势。肺癌病例之中,非小细胞肺癌(NSCLC)的比例约为80~85%,且多为腺癌。近年来,针对NSCLC的诊断和治疗取得了一定的进步,但并未明显改变患者的总体生存率,数据显示,NSCLC患者的5年生存率仅仅维持在13%左右。硒是人体必需的微量元素,是人体内多种酶的组成成分,具有护肝、抗癌、保护心血管、调节激素分泌等诸多生物功效。最初阶段所运用的补硒剂重点为无机硒(其中的重点构成即硒酸钠与亚硒酸钠)。无机硒产生功能的剂量与毒性剂量相对较为接近,实际的安全性以及生物活性都相对偏低,当前该药物已经被活性相对偏高,同时也不存在毒害问题的纳米硒粒子(selenium nanoparticles,SeNPs)所取代。与硒代蛋氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸和亚硒酸钠相比,SeNPs具有较低的毒性和较高的抗癌效果,因此而得到广泛的关注。目前已经提出的关于SeNPs抗癌机制,包括促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、调节氧化还原状态、使致癌因子失活、刺激免疫系统和抑制血管生成等。其中,SeNPs促进癌细胞凋亡被认为是其抗肿瘤的主要分子机制之一。近些年肿瘤科研界发现了一系列异于凋亡的细胞死亡方式,这些死亡方式被认为对肿瘤发展起重要的调控作用。然而,SeNPs是否参与这些细胞死亡尚需阐明。本研究论文分为三部分:(一)SeNPs的生物合成、表征鉴定及其抑制非小细胞肺癌作用研究;(二)基于RNA-seq检测的SeNPs相关非小细胞肺癌关键基因筛选与鉴定;(三)SeNPs促进非小细胞肺癌自噬发生研究。三个部分相互成递进关系,后续的研究以前一部分为基础,又相辅相成,互相印证。二、方法1、利用大肠杆菌生物学方法合成SeNPs;采用紫外-可见吸收光谱技术对SeNPs进行进行表征鉴定;利用透射电镜测定SeNPs的尺寸和外形;利用能谱仪测定合成粒子的元素成分,以最终确定合成产物的纯度及表征等参数指标;2、利用X射线与合成的SeNPs双重处理非小细胞肺癌细胞系A549,利用MTT法、caspase-3活性检测试剂盒及免疫荧光法检测SeNPs对A549细胞的抑制作用;3、利用RNA-seq技术对A549细胞空白对照组、X射线组、SeNPs组及X射线+SeNPs组的转录本进行定量,并筛选鉴定出具有差异表达的关键基因;4、利用qRT-PCR技术、western-blotting技术及ELISA技术验证关键基因在组间的差异表达;5、利用western-blotting技术、激光共聚焦显微镜成像技术及电子显微镜成像技术测定自噬在组间发生的差异;6、利用关键蛋白抑制剂为探针,测定SeNPs抑制A549细胞增殖的分子机制。三、结果第一部分SeNPs的生物合成、表征鉴定及其抑制非小细胞肺癌作用研究本部分利用大肠杆菌合成了SeNPs,并采用紫外-可见吸收光谱技术对SeNPs进行了表征鉴定。通过X射线及电子显微镜成像发现,所合成的SeNPs具有衍射环图案六角形环状的全新结构。利用能谱仪测定元素成分,确定了合成的纳米颗粒主要元素成分为硒;在此基础上,发现新合成的SeNPs对A549细胞增殖具有强效的抑制作用,而对正常对照细胞的抑制作用相对较弱。同时,SeNPs可上调A549细胞中caspase-3的活性,并促进细胞死亡,这些结果提示SeNPs上调A549细胞凋亡可能是其抑制细胞增殖的主要因素。第二部分基于RNA-seq检测的SeNPs相关非小细胞肺癌关键基因筛选与鉴定本部分将非小细胞肺癌细胞A549分为四组,分别为空白对照组,X射线组、SeNPs组及X射线+SeNPs组。提取各组细胞RNA进行RNA-seq分析,鉴定出一系列在组间存在差异表达的基因。通过对差异表达基因数据进行GO和KEGG聚类分析发现,部分基因参与调控重要的细胞功能,如细胞坏死、自噬(autophagy)、凋亡和炎症。经qRT-PCR,ELISA及western-blotting等分子生物学技术初步验证,发现部分炎症相关基因,如COX-2和iNOS在SeNPs处理的二、方法A549细胞中显著上调。结果提示,SeNPs对细胞炎性因子分泌的调控作用,可能是其促细胞凋亡、抑制肿瘤发生的关键因素。第三部分SeNPs促进非小细胞肺癌自噬发生研究自噬是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式,其特征为依赖于ATG信号通路,并伴有大量自噬小体及自噬溶酶体生成。第二部分的RNA-seq结果发现了一系列差异表达的自噬相关基因(ATG),本部分首先利用qPCR技术,证实ATG5和BECN1在SeNPs刺激的A549细胞中显著上调;同时western blotting检测发现SeNPs刺激的A549细胞中自噬相关蛋白LC3-II/LC-I比率显著升高,而SQSTM1表达量显著降低;利用电子显微镜观察自噬溶酶体数量、利用激光共聚焦技术对LAMP1与LC3的共定位分析,这些经典的自噬研究实验证实了SeNPs可以促进A549细胞自噬发生;应用自噬抑制剂、炎性因子iNOS抑制剂和凋亡抑制剂处理细胞后,发现自噬抑制剂可显著阻断SeNPs对A549的细胞增殖的抑制作用,说明SeNPs对A549的抑制部分是通过上调细胞自噬实现的。结论本研究所合成的SeNPs具有衍射环图案六角形环状的全新结构。新合成的SeNPs抑制A549细胞增殖,并能调控其大量的基因表达,部分受控基因与凋亡、自噬、坏死等细胞死亡相关,另有部分炎性因子也被证实受SeNPs调控。实验表明SeNPs对A549的抑制部分是通过上调细胞自噬实现的。本研究提示SeNPs抑制A549细胞增殖可能不仅仅因为其可促进细胞凋亡,也可能是通过另一些死亡方式,比如自噬发生。本研究结果可使人们对SeNPs抗癌机制更深入全面的了解,为后续SeNPs应用于临床抗癌研究提供理论基础。