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CTCF在人类基因组上的结合位点达数万个之多,在基因转录调节的各个方面起到非常多样化的作用,越来越多的证据表明CTCF在染色质高级结构的组织过程中也起到重要作用。我们实验室在CTCF功能研究过程中,发现它参与了DNA损伤修复特别是DNA双链断裂的修复过程,在其他文献中鲜有相关报道。本文首先通过依托泊苷处理CTCF敲低细胞,彗星实验检测其DNA损伤情况较正常细胞严重,证实CTCF可能参与DNA损伤修复。在研究过程中,以shRNA或siRNA形式的RNA干扰方式敲低CTCF存在操作过程繁琐、敲低效果不稳定的缺点。为了获得稳定高效的CTCF缺失细胞,更好地研究CTCF的功能特别是其参与DNA损伤修复,此文利用CRISPR/Cas9系统在基因组层面敲除CTCF进行了多方面的实验研究。 针对CTCF基因设计3条靶序列,分别靶向CTCF的Exon4、Exon4和Exon7,克隆至相应的sgRNA表达载体后, CRISPR/Cas9质粒转染到HEK293T细胞。通过T7E1法检测基因组CTCF indel突变,挑选出一条最为有效的CTCF靶序列用做后续实验。接着我们对单质粒和双质粒CRISPR/Cas9系统在CTCF的敲除做了对比,在使用相同靶序列的情况下,两者对细胞基因组CTCF的敲除效率无显著差别大约在20%左右。由于CTCF是细胞生命活动所必须的看家基因,CRISPR/Cas9系统转导细胞敲除CTCF比例始终维持在低水平,亦无法获得CTCF完全敲除的单克隆细胞。 随后本文通过慢病毒包装Tet-ON系统控制的Cas9质粒pCW-Cas9感染细胞,获得稳定的受强力霉素诱导表达Cas9的细胞,进而通过转导靶向CTCF的sgRNA得到诱导敲除CTCF细胞。此细胞受强力霉素诱导表达Cas9蛋白,持续表达向导RNA,可以控制包括CTCF在内的必须基因的诱导敲除,将会方便对此类基因功能研究。实验中我们首先通过慢病毒包装pCW-Cas9质粒,感染293T细胞获得在细胞基因组随机整合Cas9诱导表达序列的HEK293T细胞Cas9-293T。然后我们发现无强力霉素存在时,Cas9-293T亦可少量表达Cas9即存在泄露效应;而当转导sgRNA后,强力霉素存在时CTCF诱导敲除比例偏低。为此我们还需要通过有限稀释获得最高效诱导Cas9表达且泄露效应最低的细胞单克隆以做进一步实验之用。另外本论文也对源于张峰实验室的Rosa26-Cas9敲入Cas9持续表达小鼠做了前期的繁育配种纯合子筛选及基因型鉴定工作,为实验室在小鼠体内或体外方便地进行基因编辑打好基础。