研究目的:人类辅助生殖技术是不孕患者寻求生育的重要治疗手段。常规体外受精（in vitro fertilization,IVF）是将不孕不育夫妇的卵子和精子取出体外,在体外培养系统中受精并发育成胚胎的技术。卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是基于传统的IVF衍生的辅助生殖技术,即在少量或无外源性促性腺激素的刺激下,从窦卵泡中取出未成熟卵母细胞,在体外进行培养、受精,然后将胚胎移植到母亲体内。IVM主要适用于卵子成熟障碍的不孕患者,特别是有多囊卵巢综合症、卵泡发育迟缓和卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）风险的患者;另外,适用于有持续高雌激素状态禁忌症患者及有生育力保存愿望的癌症患者,这种技术被认为是一种更安全、便宜且简单的治疗方法。但是,卵母细胞成熟机制尚未完全探明,IVM技术还未被广泛接受,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞成熟度、发育能力、囊胚形成率、植入率、妊娠率和活产率不理想,同时胚胎发育异常和胚胎停滞的发生率相对较高。卵母细胞微环境是卵母细胞获得发育能力的关键,不充分的培养条件是卵母细胞发育能力下降的主要原因。因此,开发一种模拟体内卵母细胞发育环境的三维（three dimensional,3D）培养体系,改善卵母细胞体外发育潜能和妊娠结局,将有望为寻求辅助生殖技术帮助的患者带来福音。在卵母细胞的发育过程中,卵母细胞与周围的颗粒细胞（granulosa cells,GCs）通过缝隙连接和旁分泌信号双向调节,在卵母细胞的代谢、减数分裂的恢复和受精等过程发挥重要的作用。目前的IVM培养体系因其培养方法的限制去除了卵母细胞与其周围的GCs的联系,影响了卵母细胞的发育潜能。有研究发现,GCs与卵母细胞共培养促进了卵母细胞胞质成熟,改善了胚胎质量,使其与体内成熟的卵母细胞基因表达谱类似。卵泡内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）为卵泡提供结构支撑并通过与细胞表面整合素受体结合启动多种细胞内信号级联反应,调节细胞增殖、存活、分化、类固醇形成,促进卵泡发育和成熟。研究发现ECM的主要成分纤连蛋白和层粘连蛋白（Laminin）能够促进卵母细胞减数分裂,卵泡的发育与卵巢的物理压力和组织硬度有关。目前有多项研究采用海藻酸盐、明胶、透明质酸和基质胶等材料建立卵泡体外3D培养模型,但是这些材料使用时操作复杂,需改变温度和PH以建立3D结构,使用裂解酶以获得成熟卵泡,不能提供稳定的卵泡培养环境。水凝胶材料由于其生物化学特性和物理特性的平衡,无需改变外界环境即可凝胶化,能够模拟体内ECM结构,同时修饰功能性的信号分子,有利于建立卵母细胞3D培养系统,在组织工程领域具有广阔的应用前景。因此,本研究基于Laminin肽段修饰的水凝胶建立卵泡体外3D培养体系,并利用Laminin肽段修饰的水凝胶和GCs建立IVM 3D培养体系,确定Laminin肽段修饰的水凝胶对GCs和卵母细胞生物学功能的影响,初步探究其分子机制。研究方法:（1）检测Laminin肽段修饰水凝胶的理化特性,通过体外培养小鼠卵泡观察其生长发育、检测活细胞率和卵母细胞减数分裂情况,与二维（two-dimensional,2D）培养相比较并确定最适稀释比例。（2）利用Laminin肽段修饰水凝胶建立人颗粒细胞（human granulosa cells,h GCs）体外3D培养体系,应用流式细胞术、免疫荧光、PCR、Western Blot、酶联免疫吸附测定等实验技术,验证Laminin肽段修饰水凝胶3D培养对h GCs细胞周期、凋亡、激素分泌、细胞衰老、氧化应激和线粒体膜电位的影响,初步阐述其分子机制。（3）构建2D培养、无h GCs的Laminin肽段修饰水凝胶3D培养和Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs 3D培养体系,利用免疫荧光染色和荧光显微镜及共聚焦显微镜观察小鼠卵母细胞形态、纺锤体、染色体、皮质颗粒、内质网、氧化应激和线粒体膜电位的变化,验证不同培养体系对小鼠卵母细胞生物学功能的影响。研究结果:第一部分数据表明,Laminin肽段修饰水凝胶凝固的速度根据不同的水凝胶稀释比（1:3＞1:5＞1:7）而变化,三种稀释比储存模量分别为144Pa（1:3）、63.4Pa（1:5）和20.8Pa（1:7）。数据显示,Laminin肽段修饰水凝胶稀释比为1:5时小鼠卵泡存活率最高、直径最大、卵泡活细胞率、窦卵泡形成率、卵母细胞成熟率最高。通过测量各组卵泡直径发现,培养至第6天,2D组（191±11μm）、Laminin肽段修饰水凝胶稀释比1:5组（214±22μm）和1:7组（207±22μm）的卵泡直径均显著高于1:3组（158±10μm,p＜0.05）;培养至第10天,水凝胶稀释比1:5组（338±15μm）的卵泡直径最大,1:3组最小（180±25μm,p＜0.05）。比较四组卵泡存活率发现,体外培养过程中Laminin肽段修饰水凝胶稀释比1:3组卵泡存活率均显著低于其余各组（p＜0.05）;培养至第6天和第10天,Laminin肽段修饰水凝胶稀释比1:5组和1:7组卵泡存活率均高于2D组（p＜0.001）。另外,体外培养至第10天水凝胶稀释比1:5组卵泡的活细胞率和窦卵泡形成率均高于其余各组。再者,经IVM处理后2D组、Laminin肽段修饰水凝胶稀释比1:5和1:7组卵泡的卵母细胞成熟率分别为14.3%、34.7%和18.5%,Laminin肽段修饰水凝胶稀释比1:5组卵母细胞成熟率最高（p＜0.05）。根据以上实验结果,Laminin肽段修饰水凝胶稀释比为1:5时为卵泡生长发育提供了最适宜的物理环境,因此后续实验均使用此稀释比例进行。第二部分研究数据表明,Laminin肽段修饰水凝胶3D培养改善h GCs生物学功能。通过细胞活性检测发现,体外培养至第4、6天时,2D培养的h GCs活细胞比例显著低于3D培养的h GCs（p＜0.01）。细胞周期检测结果表明,3D培养的h GCs S期（p＜0.001）及G2-M期（p＜0.05）细胞比例显著高于2D组。细胞凋亡实验结果表明,体外培养第2、4天时,3D培养的h GCs早期凋亡的细胞比例和凋亡相关基因caspase3、caspase8、BAX的表达显著低于2D培养的h GCs（p＜0.05）。检测激素分泌情况发现,体外培养至第4天时,3D培养的h GCs分泌的抗缪勒管激素和孕酮显著高于2D培养的h GCs（p＜0.05）。另外,3D培养的h GCs衰老细胞率和衰老相关蛋白P16、P21的表达显著低于2D培养的h GCs（p＜0.05）。3D培养的h GCs氧化应激水平和抗氧化相关蛋白及基因SOD1、GPX4表达显著降低（p＜0.01）。JC-1染色和流式细胞术检测显示3D培养的h GCs有更弱的JC-1单体信号和更强的JC-1多聚体信号,经统计相对线粒体膜电位比值在3D培养的h GCs中显著升高（p＜0.05）。透射电镜证明2D培养的h GCs在体外培养48h后,结构异常的线粒体数量达到74.5±21.3%,3D培养使h GCs的异常线粒体率显著下降至28.54±11.4%。再者,3D培养的h GCs卵丘扩张相关基因及其蛋白COX2、HAS2、PTX3的表达显著高于2D培养的h GCs,3D培养使h GCs中TGFβ1、phospho-SMAD3和phospho-ERK1的表达水平增加（p＜0.05）,TGFβ-SMAD3-ERK信号通路激活。第三部分研究结果表明,Laminin肽段修饰水凝胶3D培养提高小鼠卵母细胞胞核成熟率,不影响纺锤体和染色体排列及分布,降低卵母细胞氧化应激水平,提高卵母细胞线粒体膜电位,Laminin肽段修饰水凝胶-GCs培养体系提高了皮质颗粒和内质网正常分布比例。与2D组相比,Laminin肽段修饰水凝胶3D培养组和Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs培养组中的卵母细胞成熟率显著升高（61.1±7.4%vs.72.1±11.0%vs.73.4±10.2%;p＜0.05）。另外,DCFHDA荧光探针染色显示,Laminin肽段修饰水凝胶3D培养组和Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs培养组卵母细胞的氧化应激水平显著低于2D组（p＜0.05）。JC-1荧光探针染色显示,Laminin肽段修饰水凝胶3D培养组和Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs培养组的卵母细胞线粒体荧光强度比值（红/绿）显著高于2D组（p＜0.001）。再者,皮质颗粒分布和内质网分布情况反映了卵母细胞胞质成熟,Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs培养组卵母细胞皮质颗粒III级分布占87.0%,显著高于2D和Laminin肽段修饰水凝胶3D培养组卵母细胞（p＜0.05）,Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs培养组卵母细胞成熟型内质网所占比例为84.6%,显著高于其余各组（p＜0.05）,三组卵母细胞纺锤体和染色体排列及分布均正常。研究结论:1.Laminin肽段修饰水凝胶性状稳定,能提供持久的物理环境,促进小鼠卵泡生长发育。2.Laminin肽段修饰水凝胶培养对h GCs生物学功能具有促进作用,激活了TGFβ-SMAD3-ERK信号通路。3.构建的Laminin肽段修饰水凝胶-h GCs IVM系统对卵母细胞生物学功能具有促进作用,可以改善小鼠卵母细胞的成熟效率。本研究通过模拟体内卵母细胞发育环境,利用Laminin肽段修饰的水凝胶和h GCs建立未成熟卵母细胞IVM 3D培养体系,为临床提高患者未成熟卵母细胞利用率提供了新的方法。