论文部分内容阅读
背景与目的:流行病学调查显示沙门菌是引起细菌性断奶仔猪腹泻的主要致病菌。益生菌作为潜在的抗生素替代品可有效的对抗细菌性断奶仔猪腹泻。自噬作为机体的重要防御机制,能够促进免疫系统捕获并清除病原菌,维持机体健康。本研究旨在探究益生菌对沙门菌感染断奶仔猪肠道中自噬-炎性体途径的调节机制,为科学防控断奶仔猪腹泻性疾病提供理论依据。方法:24头21日龄断奶仔猪随机分为三组:1)对照组:1-7 d灌服生理盐水10 mL;2)沙门菌组:1-7 d灌服生理盐水10 mL,8 d灌服浓度为1011 CFU/mL婴儿沙门菌(S.infantis)10 mL;3)益生菌保护组:1-7d灌服浓度为109CFU/mL的约氏乳酸杆菌(L.johnsonii)10mL,8d灌服浓度为1011 CFU/mL的S.infantis 10 mL;记录采食量、体重。第15 d麻醉后宰杀。H&E染色及透射电镜观察肠道损伤,Real-time PCR、Western blotting方法检测炎性因子表达。猪肠上皮细胞IPEC-J2预孵育 107CFU/mL L.johnsonii,然后感染 S.infantis 108CFU/mL。检测细胞活性,电镜观察细胞损伤情况,JC-1检测细胞线粒体膜电位变化,DHE检测细胞内氧化物含量,Real-timePCR方法检测相关炎性因子及受体表达,Western blotting方法检测自噬相关蛋白及炎性体蛋白表达,免疫荧光定位细胞内沙门菌、线粒体与自噬体。24头21日龄断奶仔猪随机分为三组处理方式如上(1010)CFU/mL的沙门菌单相变异菌株(monophasicvariant Salmonella)、109CFU/mL 的鼠李糖乳酸杆菌 GG 株(LGG))。第15 天,全部麻醉后宰杀,评价腹泻情况及肠道炎症。外周血淋巴细胞计数,Real-time PCR方法检测肠道组织离子通道、炎性因子及受体表达,Western blotting方法检测肠道炎性体相关蛋白表达,流式细胞术检测分析外周血和肠道相关淋巴组织中先天样淋巴细胞亚群动态变化。结果:口服L.johnsonii可改善S.infantis引起的仔猪发热,腹泻等症状,降低炎性因子的表达。Sinfantis感染IPEC-J2细胞3 h后引起线粒体膜电位下降,促进ROS的释放,刺激细胞及回肠中NLRP3和ASC表达。S.infantis促进细胞中TLR9、Cytochrome C的表达,预孵育L.johnsonii可抑制线粒体损伤,并在感染后期促进细胞内Parkin和LC3蛋白的表达,但不引起PINK1的表达。单相变异沙门菌诱导仔猪空肠中TLR5和TLR4的表达,同时增加IL-8和IL-6 mRNA表达。单相变异沙门菌刺激回肠中NOD1和NOD2 mRNA的表达,促进IλB-α的磷酸化,激活NF-κB通路并促进炎性细胞因子的释放。口服LGG可减弱沙门菌诱导的空肠和回肠组织NOD1 mRNA表达的增加,同时促进不同肠段中分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)的分泌。LGG阻止NLRP6/ASC/Caspase-1炎性体的活化并减少了回肠中IL-18的产生。但NLRP3炎性体在试验中无明显变化。结论:S.infantis可引起肠道上皮细胞线粒体损伤,发生氧化应激,L.johnsonii可通过PINK1/Parkin途径激活细胞选择性的线粒体自噬,抑制NLRP3炎性体的激活。单相变异沙门菌感染仔猪虽不影响其生长性能、粪便等级等,但会导致肠炎的发生,口服LGG可加速单相变异沙门菌的排出,LGG可通过阻止经典NF-κB途径的活化抑制由NLRP6介导的炎症反应以及促炎因子的表达。