霜霉病是黄瓜叶片主要病害之一,自1868年在古巴被发现以来,现已危害全球70多个国家的黄瓜生产。目前,对于黄瓜霜霉病抗性相关的研究较多,虽取得了一定进展,但未有重大突破。已经报道的QTL位点分散在chr1、chr5和chr6上,缺少紧密连锁且简便实用的分子标记,并且由于育种实践中不同种质资源的遗传背景存在差异,限制了这些标记在育种中的应用。另外,抗病基因或QTL的精细定位和图位克隆进展缓慢,至今尚未见到成功克隆黄瓜霜霉病抗病基因或QTL并完成功能验证的报道,无法满足在育种实践中辅助选择和种质创新的需要。如何进一步深入挖掘黄瓜抗霜霉病基因,加速抗病分子育种进程,成为黄瓜抗病育种亟待解决的课题。本研究从以下两个方面开展工作:一方面,以抗性基因为研究目的。利用高抗黄瓜霜霉病的纯合自交系K8和感病材料新泰密刺选系K18为亲本,构建含有86个单株的RIL群体,分别在苗期、成株期对群体进行抗病性鉴定,结合构建的分子标记遗传图谱,对苗期和成株期的霜霉病抗性进行相关性分析,对黄瓜霜霉病抗性基因进行QTL定位,并在定位区域内进行候选基因分析,确定11个与抗性相关的基因,在两亲本间对其进行克隆和序列分析。另一方面,研究霜霉病感病基因。通过同源序列比对和系统进化树分析,确定黄瓜霜霉病感病候选基因。克隆具有不同遗传背景、不同抗性的15份黄瓜材料的感病候选基因,比较克隆序列,寻找差异。并对有突变的和无突变的基因序列进行蛋白质一级结构的预测,确定变异点是否引起氨基酸的变化。同时对该候选基因进行一系列的生物信息学分析:(1)预测其基因结构和结构域(2)与已知功能的拟南芥同源感病基因氨基酸进行多序列比对(3)预测蛋白质二级和三级结构。具体研究结果如下:(1)利用2112对SSR引物对亲本K8和K18进行多态性筛选,得到112个多态性标记;将多态性标记在RIL群体上进行SSR分析,数据统计后,使用Join map软件构建分子连锁图谱。图谱包含7个连锁群,与黄瓜的7条染色体对应,86个标记,总长度513.2cM,分子标记之间的平均遗传距离为5.97cM。(2)对RIL群体进行霜霉病苗期人工接种抗病性调查和田间成株期抗病性调查,利用MapQTL4.0的复合区间作图法(MQM)作图,结合RIL群体的病情指数进行QTL定位分析,结果三次试验均在chr5上检测到2个QTL位点dmQTL5.1和dmQTL5.2。dmQTL5.1在标记SSR16110-SSR11012之间,LOD值为14.17,贡献率高达53.6%。dmQTL5.2在标记SSR26904-SSR14194之间,LOD值为8.85,贡献率达到31.1%。另外,苗期接种数据的定位结果还在chr6找到一个微效位点dmQTL6.1,LOD值为1.72,贡献率为9.4%。(3)春季,秋季的成株期霜霉病抗性与苗期的相关性均达到极显著水平,相关系数分别为:0.61542和0.67648。(4)利用生物信息学,在主效QTL位点dmQTL5.1的区域进行基因及功能的预测,在物理范围约4319kb的两标记SSR16110-SSR11012之间,共有397个候选基因。其中,与抗性相关的基因主要有11个富含LRR的抗病蛋白基因;10个转录因子相关蛋白基因;20个锌指蛋白基因;1个逆境调控蛋白基因。(5)设计引物克隆了11个富含LRR的抗病蛋白基因的DNA全长,测序并进行序列分析。结果表明11个候选基因中,有两个基因Csa5M464830.1和Csa5M495930.1在两亲本之间存在序列上的差异,且会改变相应的氨基酸序列。其中Csa5M464830.1基因在抗性亲本K8上出现的差异更大,导致了基因后部大片段无法翻译成氨基酸,致使蛋白重要的结构域缺少,造成相应蛋白功能的丧失。(6)在黄瓜上克隆了拟南芥DMR6同源基因CsaDMR6-2的cDNA全长,并对其结构进行了分析。用15份遗传背景和抗性不同的黄瓜材料克隆拟南芥DMR6的同源基因Csa DMR6-2,通过序列比对发现,欧洲类型的抗病材料K15和K58的CsaDMR6-2的CDS序列在856bp处有一个碱基的突变,引起相应氨基酸由丝氨酸(TCA)变成丙氨酸(GCA),进而引起其部分蛋白质二级和三级结构的变化;CsaDMR6-2与拟南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性,且同属于一类氧化酶,两者具有相同的结构域,而抗病材料的变异位点均发生在催化区。