血管抑制素与内皮抑制素(AS-ES)在大肠杆菌中的融合表达及鉴定

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本文首先以人肝脏组织RNA为模板,利用高保真酶进行RT-PCR分别得到了血管抑制素和内皮抑制素基因,将AS、ES片段通过Linker连接形成融合基因,构建了原核表达质粒pET-42(b)/AS-ES,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,在IPTG的诱导下得到了目的蛋白的表达。通过对培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件优化,确定实验室规模下最佳表达条件为2×YT培养基,1.0mMIPTG,42℃诱导3h以上,最高表达丰度达到菌体总蛋白的14﹪。表达产物经过超声波破碎、12﹪SDS-PAGE鉴定为主要以包涵体形式表达,分子量约65KD。Western-blotting检测表明表达产物对血管抑制素和内皮抑制素的抗体均有特异的免疫反应;表达产物经过包涵体复性、肝素亲和柱纯化后进行鸡胚尿囊膜实验证明复性后的蛋白具有抑制血管生成的活性。
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