论文部分内容阅读
基因组靶向修饰技术对基因功能研究、基因治疗以及转基因育种研究等都具有重要的意义和价值,其中,特异性核酸内切酶的开发是基因组靶向修饰研究中的关键。锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)的发展为基因组靶向修饰研究提供了有效的技术手段。但是,特异性高效ZFNs的复杂筛选和TALENs的繁琐组装过程依旧是一个重大的技术挑战,并严重制约着动物基因编辑育种研究等相关领域的发展速度;因此,亟待开发一种经济高效、简单快捷、能够应用于哺乳动物的特异性核酸内切酶技术。2012年,源于酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas免疫系统被首次在体外研究中应用于DNA分子的靶向切割,引发了业界的广泛关注。而早在2011年,嗜热链球菌的II型CRISPR/Cas系统CRISPR3就已经被证明能在大肠杆菌中特异性的切割外源质粒DNA。本研究在这种背景下展开,我们希望以嗜热链球菌CRISPR3系统为基础,开发一种新型的核酸酶技术,为以后进一步的基因组靶向修饰和动物基因编辑育种研究奠定基础。本研究中我们首先成功克隆得到了嗜热链球菌的Cas9基因并成功实现了其在酵母中的表达。然后我们相继建立了酵母St CRISPR/Cas9表达系统、基于Gal4报告载体的酵母活性验证系统、整合型酵母报告菌株系统、哺乳动物St CRISPR/Cas9表达系统、基于Ds Red-e GFP双荧光报告载体的哺乳动物细胞活性验证系统以及整合型HEK293T报告细胞系系统,分别在酵母中报告载体水平、酵母基因组整合水平、哺乳动物细胞中报告载体水平、哺乳动物细胞基因组整合水平和哺乳动物基因组内源基因水平对St CRISPR/Cas9系统进行了有效的活性验证和打靶应用研究,为后续的应用研究积累了丰富的经验。本研究的主要结果如下:1.建立了酵母St CRISPR/Cas9表达系统和基于Gal4报告载体的酵母活性验证系统,初步确认了St CRISPR/Cas9核酸酶系统能够在酵母细胞中工作。针对于sg RNA的不同结构域的研究取得了一系列新的发现,其中最重要的是发现了tracr RNA 3’-末端和Bulge结构的重要性。St CRISPR/Cas9系统具有位置依赖性的脱靶效应,导向靶序列3’-端5 nt对St CRISPR/Cas9特异性有着决定性作用;另外,r G::d T的配对方式可能存在于sg RNA识别相应靶序列DNA分子的过程中,会造成很严重的脱靶效应。最后设计获得了结构优化精简的sg RNA.Opti和密码子人源化优化的h St Cas9,对St CRISPR/Cas9系统的活性均有不同程度的提高,采用sg RNA.Opti/h St Cas9组合在酵母活性验证试验中的最高活性为14.32%。2.建立了整合型酵母报告菌株系统,通过对不同SSA同源臂长度的报告菌株的比较,证明了报告菌株采用20 bp的SSA同源臂是可行的;通过酵母报告菌株转化试验和基因组中Gal4基因修复的检测初步证明了St CRISPR/Cas9系统能够打靶酵母基因组DNA;优化后St CRISPR/Cas9系统在酵母基因组水平的打靶活性比优化前提高了一倍,最高活性为6.64%。3.建立了哺乳动物St CRISPR/Cas9表达系统和基于Ds Red-e GFP双荧光报告载体的高效的哺乳动物细胞活性验证系统,进一步确认了St CRISPR/Cas9核酸酶系统能够在哺乳动物细胞中工作。采用了菌源的b St Cas9基因和密码子优化的h St Cas9基因,以及8种不同的导向RNA表达策略进行了比较研究,结果发现:菌源的b St Cas9基因,由于其在HEK293T细胞中的表达活性很低,不利于St CRISPR/Cas9系统活性的发挥;发夹结构的sg RNA在人HEK293T细胞中有可能会被降解,引入引导序列或者采用cr RNA::tracr RNA则能相对提高系统的活性;h St Cas9基因在HEK293T中的充分表达有利于对sg RNA分子的保护,极大的提高了St CRISPR/Cas9系统的活性;St CRISPR/Cas9系统在HEK293T细胞活性验证试验中的最高活性为41.39%。4.建立了整合型HEK293T报告细胞系系统,在HEK293T报告细胞系中初步证明了St CRISPR/Cas9系统能够实现对哺乳动物基因组DNA的高效打靶;通过SP1.sg RNA.WT/h St Cas9和SP1.sg RNA.Opti/h St Cas9组合对293T.SP1.P5M4和293T.SP1.PAM5两种细胞系进行交叉打靶的脱靶效应检测验证了St CRISPR/Cas9系统的特异性。5.采用St CRISPR/Cas9核酸酶系统对HEK293T内源的CCR5a、CCR5b和AAVS1三个靶序列打靶效率分别为:20.84%、26.68%和15.46%;最终证明了本研究所建立的哺乳动物St CRISPR/Cas9核酸酶系统能够用于基因组内源基因的高效打靶。