目的根据国际癌症研究机构数据,目前全球范围内,结肠癌发病率在恶性肿瘤发病中排名第三,结肠癌死亡率在恶性肿瘤相关死亡中排名第四,中国的发病人数和死亡人数均位居世界各国之首。根据我国国家癌症研究中心数据,中国的结肠癌发病人数和死亡人数逐年上升,中国在防治结肠癌方面正面临着巨大挑战。与其他恶性肿瘤一样,结肠癌的主要治疗手段为手术和放、化疗,然而,手术和放、化疗对患者术后生存期的延长和术后生存质量的改善十分有限。不同的是,根据临床研究数据,80%的结肠癌可通过结肠镜镜检等早期筛查手段结合手术切除术、药物干预等方法在其发病早期对其进行有效诊断和干预,由此可见,药物干预是目前结肠癌防治的重要环节之一。临床常用的肿瘤化疗药物常有严重的不良反应,不适合作为结肠癌早期干预和防治的用药,因此,寻求安全有效的结肠癌早期干预用药对有效降低结肠癌发病率,减缓结肠癌发病进程有着一定的临床意义。青蒿素及其衍生物是国际上目前使用最为广泛的抗疟药物,具有速效、高效、低毒的药效优势。不少报道表明,青蒿素类药物具有良好的抗肿瘤活性,部分已进入临床研究,并取得了可观的疗效。已有的临床研究数据表明,青蒿琥酯可显著降低结肠癌复发风险。这一结果提示我们,青蒿素及其衍生有可能是较为理想的结肠癌防治药物,但其对结肠癌的作用机制仍有待于进一步探索。表观遗传理论解释了人类疾病进程中出现的一些无法用遗传学理论解释的现象。结肠癌发病全过程中伴有不同程度和不同形式的表观遗传修饰的异常改变,部分基因的表观遗传改变已成为结肠癌诊断、治疗以及预测的参考标志。越来越多的研究报道显示,天然活性产物对肿瘤表观遗传有良好的调控作用,是开发表观遗传药物的重要来源。我们课题组前期研究表明,青蒿素衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯对肺癌的表观遗传学有一定的调节作用。在已有临床研究报道的导向下,根据已有的研究基础,我们选择青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯作为研究对象,评价这三个药物对结直肠癌的作用效果,并对效果最好的化合物进行药效机制研究,同时考察该化合物对结肠癌表观遗传学的影响。方法1.青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯对结肠癌细胞系SW480、HCT116、HT29活力的影响结肠癌细胞系SW480、HCT116、HT29分别给予不同浓度青蒿素（0～100μM）、双氢青蒿素（0～64μM）和青蒿琥酯（0～64μM）处理72 h,MTT法检测这三个对细胞活力的影响,计算细胞存活率和IC50。采用平板克隆形成实验,考察长期给药（14天）对结肠癌细胞SW480、HCT116细胞活力的影响。2.青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯对结肠癌细胞系SW480、HCT116增殖的影响青蒿素（12.5、25、50μM）、双氢青蒿素（1、2、4μM）和青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480、HCT116细胞72 h后,细胞更换1 m L CFSE（5μM）继续孵育3～6 h,流式细胞术检测细胞内CFSE荧光强度,检测药物对SW480、HCT116细胞分裂的影响。Ed U掺入法检测双氢青蒿素（1、2、4μM）、青蒿琥酯（1、2、4μM）处理72 h对SW480、HCT116细胞DNA合成的影响。3.青蒿琥酯对结肠癌细胞系SW480、HCT116细胞周期的影响青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480、HCT116细胞72 h,PI染色结合流式细胞分析术分析SW480、HCT116细胞周期分布变化情况,western blot技术考察SW480、HCT116细胞内周期相关蛋白水平变化。4.青蒿琥酯对结肠癌细胞系SW480、HCT116凋亡的影响青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480、HCT116细胞72 h,Anexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测SW480、HCT116细胞凋亡水平,western blot技术检测SW480、HCT119细胞内凋亡相关蛋白表达的影响。5.青蒿琥酯对PI3K-AKT信号、p53信号、MAPK信号、内质网应激的影响青蒿琥酯（2μM）处理SW480细胞72 h,抽提总RNA,RNA-seq筛选SW480细胞的差异表达基因,并对差异表达基因进行显著性通路富集分析。q PCR验证RNA-seq结果。青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480、HCT116细胞72 h,提取总蛋白,western blot检测SW480、HCT116细胞内PI3K-AKT信号通路相关蛋白的水平变化。在文献研究的基础上,western blot检测SW480、HCT116细胞内PI3K-AKT信号的上游即MAPK信号、内质网应激等相关蛋白的水平变化。6.ARTS对KDM4B的调控作用及KDM4B对结肠癌细胞周期和细胞增殖的影响根据TCGA数据,组蛋白去甲基化酶KDM4B表达水平与结肠癌患者生存相关。青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480细胞72 h,q PCR检测KDM4B m RNA水平,western blot检测细胞内KDM4B的蛋白水平,同时检测其催化底物H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3的水平变化。利用脂质体转染技术和小分子RNA干扰技术抑制SW480内源性KDM4B的表达,PI染色法检测细胞周期,CFSE染色检测细胞增殖,western blot检测PI3K-AKT信号、p53信号、MAPK信号等相关蛋白表达情况以寻找KDM4B可能调控的靶基因。7.体内实验验证青蒿琥酯对结肠癌增殖的抑制作用裸鼠右侧腋窝皮下注射SW480细胞悬液,5×106细胞/只裸鼠,建立SW480移植瘤模型。肿瘤体积长至50～100 mm3时开始青蒿琥酯给药,每周给药5次,连续给药4周,给药浓度60 mg/kg。给药期间,每72 h称量一次体重,测量肿瘤体积。给药结束后,剥离肿瘤组织及心脏、肝脏、脾脏、、肺脏和肾脏,称取瘤重和脏器重量,并计算脏器指数。提取肿瘤组织总蛋白,检测PI3K-AKT信号通路、内质网应激、MAPK信号通路、KDM4B等相关蛋白的表达水平。结果1.青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯显著抑制结肠癌细胞系SW480、HCT116、HT29活力青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯处理72 h在SW480细胞中的IC50值分别为31.59、2.637、3.159μM,在HCT116中的IC50值分别为31.69、4.628、2.756μM,在HT29细胞中的IC50值分别为>100、11.54、9.543μM。SW480、HCT116经三种药物处理14天后的相对克隆形成率均显著降低（p<0.001）。2.青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯抑制结肠癌细胞系SW480、HCT116细胞分裂和DNA合成不加药物处理的SW480细胞中CFSE荧光强度较低（1014±38）,不同浓度双氢青蒿素（1、2、4μM）处理过的SW480中CFSE的荧光强度依次为1492±35（p<0.001）、1725±51（p<0.001）、1803±52（p<0.001）。不同浓度青蒿琥酯（1、2、4μM）处理过的SW480中CFSE的荧光强度依次为1353±44（p<0.001）、1590±36（p<0.001）、1694±53（p<0.001）。不加药物处理的HCT116中CFSE的荧光强度为838±36,不同浓度双氢青蒿素（1、2、4μM）处理过的HCT116中CFSE的荧光强度依次为1689±122（p<0.001）、2025±197（p<0.001）、1901±130（p<0.001）。不同浓度青蒿琥酯（1、2、4μM）处理过的HCT116中CFSE的荧光强度依次为1399±77（p<0.001）、1998±177（p<0.001）、1929±162（p<0.001）。青蒿素给药处理对SW480、HCT116细胞中CFSE荧光强度变化的影响不明显。未经药物处理的SW480细胞中Ed U掺入率为36.57%±6.85%,不同浓度的双氢青蒿素（1、2、4μM）处理72 h SW480中Ed U的掺入率依次为14.43%±2.54%（p<0.05）、9.79%±2.29%（p<0.01）、7.18%±4.82%（p<0.01）,不同浓度的青蒿琥酯（1、2、4μM）处理72 h SW480中Ed U的掺入率依次为10.45%±3.63%（p<0.05）、4.62%±3.44%（p<0.05）、4.06%±2.47%（p<0.01）。未经药物处理的细胞Ed U掺入率为64.23%±9.21%,不同浓度的双氢青蒿素（1、2、4μM）的HCT116中Ed U的掺入率依次为22.63%±3.37%（p<0.01）、17.85%±4.01%（p<0.01）、11.51%±2.63%（p<0.01）,不同浓度的青蒿琥酯（1、2、4μM）处理72 h的HCT116中Ed U的掺入率依次为10.51%±4.17%（p<0.01）、9.97%±4.97%（p<0.01）、2.92%±1.67%（p<0.001）。3.青蒿琥酯将结肠癌细胞系SW480、HCT116细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期SW480经ARTS（2、4μM）)处理后,G1期细胞所占百分从57.38%±3.98%增加至73.21%±1.86%（p<0.01）、70.19%±4.57%（p<0.05）,而1μM青蒿琥酯对SW480细胞G1期细胞百分比无明显影响（56.15%±2.98%,p>005）。HCT116经青蒿琥酯（1、2、4μM）)处理后,G0/G1期细胞比例从47.02%±31.44%分别增加至59.90%±0.76%（p<0.001）、72.85%±3.89%（p<0.001）、68.16%±2.22%（p<0.001）。SW480经过不同浓度（1、2、4μM）青蒿琥酯处理72 h后,细胞内CDK2、CDK4、CDK6,Cyclin D1、Cyclin E1等促进G0/G1期进程的细胞周期正性调控蛋白水平均有不同程度的下降（p<0.001）,p16、p21等阻碍G0/G1期进程的负性调控蛋白表达上调（p<0.001）4.青蒿琥酯对结肠癌细胞系SW480、HCT116凋亡的诱导作用较弱且缓慢青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480细胞24 h、48 h,Anexin V-FITC+/PI-细胞比例、Anexin V-FITC+/PI+细胞比例、Anexin V-FITC+/PI+细胞比例均较低,小于1%。SW480经过青蒿琥酯（1、2、4μM）处理72 h后,对照组细胞和给药组细胞中Anexin V-FITC+/PI-细胞百分比依次是0.21%±0.07%、1.89%±0.06%（p<0.001）、2.48%±0.04%（p<0.001）、2.15%±0.06%（p<0.001）,对照组细胞和给药组细胞中Anexin V-FITC+/PI+细胞百分比依次是0.33%±0.08%、3.53%±0.06%（p<0.001）、4.84%±0.16%（p<0.001）、6.28%±0.10%（p<0.001）,对照组细胞和给药组细胞中Anexin V-FITC-/PI+细胞百分比依次是4.67%±0.26%、4.60%±0.05%（p>0.05）、4.94%±0.03%（p<0.05）、5.83%±0.01%（p<0.001）。青蒿琥酯（1、2、4μM）处理HCT116细胞24h、48h,Anexin V-FITC+/PI-细胞比例、Anexin V-FITC+/PI+细胞比例、Anexin V-FITC+/PI+细胞比例均较低,小于1%。HCT116经过青蒿琥酯（1、2、4μM）处理72 h后,对照组细胞和给药组细胞中Anexin V-FITC+/PI-细胞百分比依次是1.41%±0.22%、1.04%±0.07%、2.28%±0.18%（p<0.01）、3.39%±0.21%（p<0.001）,对照组细胞和给药组细胞中Anexin V-FITC+/PI+细胞百分比1.68%±0.11%、0.77%±0.09%、2.13%±0.03%（p<0.01）、3.10%±0.04%（p<0.001）,对照组和给药组细胞中Anexin V-FITC-/PI+细胞比例依次是5.58%±0.20%、2.85%±0.14%、4.86%±0.36%、5.61%±0.23%。5.青蒿琥酯对PI3K-AKT信号、MAPK信号和内质网应激的影响对RNA-seq结果进行信号通路显著性富集分析,结果表明,青蒿琥酯（2μM）可以调节SW480细胞中PI3K-AKT信号通路。q PCR验证结果显示,青蒿琥酯（2μM）可使SW480细胞中PI3K-AKT信号通路正性调控基因AKT m RNA的相对水平下调至对照组的0.36±0.01倍（p<0.001）,PI3K-AKT信号通路负性调控基因PTEN、TP53m RNA水平分别上调至对照组的1.22±0.04倍（p<0.001）、2.13±0.26倍（p<0.001）。Western blot结果表明,青蒿琥酯显著下调SW480、HCT116、HT29细胞中PI3K-AKT信号通路正性调控蛋白AKT、PI3K的蛋白水平（p<0.001）,同时上调PI3K-AKT信号通路负性调控蛋白PTEN、p53蛋白水平（p<0.001）。文献研究表明,内质网应激相关通路和ERK MAPK通路是PI3K-AKT信号通路的上游调控信号,过度激活的内质网应激信号可以抑制PI3K-AKT信号,ERK MAPK通路可激活PI3K-AKT信号。Western blot结果表明,随着给药浓度的升高,SW480、HCT116、HT29细胞中ERK1/2蛋白水平下降（p<0.001）,内质网应激相关正性调控蛋白BIP、IRE1α、PDI、CHOP等蛋白水平显著升高（p<0.001）。内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸可下调IRE1α的蛋白水平（p<0.05）,上调PI3K的蛋白水平（p<0.001）。牛磺熊去氧胆酸与青蒿琥酯共处理HCT116后,牛磺去氧胆酸可减弱青蒿琥酯对IRE1α、PI3K蛋白表达的调节（p<0.001）.同时,牛磺熊去氧胆酸可削弱青蒿琥酯对增殖作用（p<0.05）。6.ARTS对KDM4B的调控作用及KDM4B对结肠癌细胞周期的影响根据TCGA生存数据分析结果,组蛋白去甲基化酶KDM4B低水平患者有较长的中位生存期。青蒿琥酯（1、2、4μM）处理SW480、HCT116细胞72 h后,细胞中KDM4B的m RNA水平和蛋白水平均显著降低（p<0.001）,KDM4B的催化底物H3K9me2水平的上升（p<0.001）。SW480的内源性KDM4B经小分子RNA（si RNA）干扰技术抑制其表达后,KDM4B m RNA水平降低为未沉默细胞的0.26±0.03倍（p<0.001）,蛋白水平下降至未沉默细胞的21.01%±1.59%（p<0.001）,KDM4B的催化底物H3K9me1、H3K9me2水平上升（p<0.001）。与未沉默细胞相比,SW480经KDM4B沉默后,细胞内CFSE的平均荧光强度由996±23上升至1507±33（p<0.01）,G0/G1期细胞比例由58.93%±1.92%增加至70.29%±3.43%（p<0.01）,p16、p21蛋白水平上升（p<0.001）,与ARTS对SW480细胞增殖和细胞周期的影响相似。此外,SW480经过KDM4B沉默后,细胞中PI3K蛋白表达水平下调（p<0.001）。内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸可上调KDM4B蛋白水平（p<0.001）。青蒿琥酯可抑制牛磺熊去氧胆酸诱导的KDM4B的表达上调（p<0.001）。7.青蒿琥酯抑制结肠癌增殖体内实验青蒿琥酯显著抑制SW480结肠癌移植瘤在裸鼠体内的生长（p<0.05）,溶剂对照组和青蒿琥酯给药组瘤重分别为1.13 g±0.34 g、0.49 g±0.05g（p<0.05）,肿瘤抑制率56.61%±4.74%,对体重和脏器指数无显著影响。与溶剂对照组比较,青蒿琥酯给药组肿瘤组织中PI3K、AKT、ERK1/2蛋白水平下降（p<0.001）,p53、PTEN、BIP、IRE1α、CHOP的蛋白水平升高（p<0.001）。与溶剂对照组比较,青蒿琥酯给药组肿瘤组织中KDM4B蛋白水平下降（p<0.001）,其底物H3K9me1、H3K9me2水平升高（p<0.001）。结论根据MTT、平板克隆形成实验、CFSE染色、Ed U掺入等细胞增殖检测实验和Anexin V-FITC/PI染色实验等细胞凋亡检测实验,我们发现青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯可显著地抑制结肠癌细胞的增殖,青蒿琥酯的抑制效果最好,同时,青蒿琥酯对细胞凋亡的诱导作用较弱且作用速度缓慢。进一步研究结果表明,青蒿琥酯通过显著诱导内质网应激,进而下调PI3K、AKT蛋白水平,同时上调PTEN、p53蛋白水平,发挥抑制结肠癌细胞增殖的作用。值得注意的是,实验结果显示,组蛋白去甲基化酶KDM4B是内质网应激的潜在下游靶点,PI3K是KDM4B的潜在下游靶点。内质网应激-KDM4B-PI3K信号轴可能参与调控青蒿琥酯对结肠癌增殖的抑制。内质网应激调控KDM4B的分子机制KDM4B对PI3K的调控方式,有待于进一步实验探索。