研究背景：胃癌是世界常见的恶性肿瘤之一,特别是在我国,胃癌的发病率仅次于肺癌,位居恶性肿瘤致死率的第二位。目前,胃癌的治疗以手术、化疗、放疗等综合治疗为主。对于中晚期胃癌患者,由于已失去手术的最佳时机,化疗则是最佳选择。但是随着化疗周期的增加,肿瘤的多药耐药则成为严重影响化疗效果主要原因之一。肿瘤多药耐药在临床肿瘤治疗中已普遍存在,成为目前肿瘤治疗的主要障碍之一多药耐药(MDR)是导致化疗失败的主要原因,因此肿瘤耐药成为临床上肿瘤治疗的最大挑战。在过去的几十年里,许多的理论方法被提出并用来解决这-问题,其中最重要的就是耐药逆转药物。多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构及作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。目前,用来阐述MDR产生机制的理论有多种,其中ABC转运蛋白家族中的ABCB1(MDR1/Pgp)、ABCC1-MRP1和ABCG2-BCRP是最佳的,特别是ABCB1(MDR1)编码的P-gp通过积极外排多种抗肿瘤药物在肿瘤耐药中起着关键作用。已知的P-gp的底物包括某些抗肿瘤药物,例如：紫杉醇(paclitaxel)阿霉素(doxorubicin)和长春新碱(vinblastine).近年来,肿瘤干细胞(CSC)学说的提出更加丰富了肿瘤耐药机制的研究。近年来,肿瘤干细胞(CSC)学说的提出更加丰富了肿瘤耐药机制的研究。CSC学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞,与大部分已分化和不能自我更新的肿瘤细胞相比,其具有自我更新、多向分化以及推动肿瘤生长的能力。肿瘤干细胞(CSC)学说还认为肿瘤干细胞是肿瘤耐药、转移和复发的根源,这是由于化疗药物能够杀死已分化或正在分化的肿瘤细胞却不能杀死肿瘤干细胞。盐霉素(Salinomycin)是一种羧酸聚醚类抗生素。最近,研究人员发现,盐霉素不仅可以抑制和杀灭肿瘤细胞,而且体内外实验表明其尚可抑制肿瘤干细胞。盐霉素抑制乳腺癌肿瘤干细胞比例的能力是普通化疗药物的100多倍。其作为抗肿瘤和抗肿瘤干细胞药物的机制尚未阐明,但通过诱导上皮细胞分化而非触发细胞毒性的可能性较大。进一步的研究证明,盐霉素通过克服多重耐凋亡机制的作用,诱导不同来源的人类肿瘤细胞发生大量调凋亡。最近,通过对过表达P-gp的肿瘤细胞进行药物外排实验表明盐霉素是多药耐药蛋白P-gp的较强抑制剂。研究目的：检测胃癌耐药细胞系SGC-7901/VCR的多重耐药性,分析相关耐药机制；观察和探讨盐霉素逆转SGC-7901/VCR多药耐药性的效果及机制。方法：1、选择胃癌细胞系SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞作为实验细胞,观察细胞形态,检测两种细胞的生长曲线、细胞周期、多重耐药性等体外生物学特性。2、裸鼠成瘤实验对比两细胞株在体内的致瘤性。3、通过多种实验方法分析耐药细胞SGC-7901/VCR的耐药机制：3.1流式检测两细胞系中的侧群比例,并用Western blot检测与之相关的常见ABC转运蛋白ABCG2以及MDR1/Pgp的表达；3.2流式检测胃癌干细胞标记CD44、EpCAM在两细胞的表达量及差异；3.3通过肿瘤球的培养,间接检测两细胞株中干细胞比例的差异；3.4Western blot检测常用干细胞因子Nanog、SOX-2、OCT3/4及C-myc在两细胞株的表达量及差异。4、用盐霉素处理两细胞株,通过各种实验方法观察其逆转耐药株SGC-7901/VCR的效果,并探讨其机制：4.1MTT法检测盐霉素抑制两细胞株增值的IC50值,观察耐药株是否对盐霉素耐药；4.2联合应用盐霉素和VCR,MTT检测其耐药逆转指数；4.3MDR efflux assay检测盐霉素对耐药细胞株蓄积ADM的作用；4.4流式检测两细胞凋亡率的变化及差异；4.5流式检测耐药细胞株侧群比例的变化,并用WB检测相关ABC转运蛋白的表达量变化；4.6流式检测EpCAM的表达变化；4.7不同浓度盐霉素处理两细胞株后做肿瘤球培养,观察其对肿瘤球形成的抑制作用,并WB检测相关干细胞因子的表达量变化。5、统计方法实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析：两样本比较采用独立样本t检验分析；多种样本比较One-way ANOVA比较各组细胞的差异,用LSD法进行多重比较；如果方差不齐,采用近似F检验(Welch法)及多重比较的Tamhane法分析。结果以均数±标准差(x±s)表示。结果1.耐药细胞的培养与鉴定(1).光学显微镜下观察细胞形态SGC-7901细胞呈上皮样单层排列贴壁生长,细胞大小不一,大部分以多角形细胞占优势,梭形细胞和巨大细胞所占比例均极少,细胞边界清楚,增殖较迅速,可培养3d-4d传代一次。SGC-7901/VCR细胞同样呈上皮样单层排列贴壁生长,细胞大小不一,大部分呈梭形,细胞增殖迅速,可培养3d-4d传代一次。(2).细胞增殖MTT检测测定OD值,并绘制细胞增殖曲线,SGC-7901、SGC-7901/VCR细胞均有接触抑制期、对数生长期和细胞死亡期。自第5天开始,SGC-7901/VCR和SGC-7901细胞的体外增殖能力具有统计学差异(F=24.755,P=0.000)。流式检测两株细胞的细胞周期,SGC-7901细胞的G0/G1、S和G2/M三期的比例分别为44.700±1.400%、43.366±3.197%和11.933±2.074%,SGC-7901/VCR细胞的分别为37.200±1.908%、56.133±2.747%和6.667±1.518%；SGC-7901细胞的PI(增殖指数,表示细胞的增殖活性)为55.300±1.400%,SGC-7901/VCR细胞PI为62.800±1.908%,两者之间具有统计学差异(t=-5.489,P=0.005)。(3).裸鼠体内成瘤实验注射细胞总数分别为5x106,1x106,1x105和1x104个SGC-7901/VCR细胞观察4W,均可见瘤体形成,成瘤所需要的最低细胞数仅为10000个。而SGC-7901细胞注射细胞数目1×104个,观察4W未见瘤体形成,注射1×105细胞才可见肿瘤形成。提示SGC-7901/VCR细胞较SGC-7901细胞有更强大的致瘤能力。(4).MTT检测SGC-7901/VCR细胞的多药耐药性对VCR、ADM、Taxol、DDP这四种化疗药物,SGC-7901/VCR均显示耐药性,其IC50分别为2.530±0.287μM、9.030±0.737μM、0.583±0.076gM、3.327±0.172μM,而SGC-7901细胞则相对敏感,其IC50明显较小,分别为0.073±0.020μM、0.340±0.118μM、0.066±0.008μM、1.347±0.315μM,两细胞任一相同药物之间均具有显著差异(P<0.05)。耐药细胞较亲本细胞对四种化疗药物的耐药倍数分别为36.0、27.0、7.10、2.46。2. SGC-7901/VCR细胞多药耐药机制的研究(1).流式检测SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞SP比例分别为0.067±0.115%和88.900±11.966%,两者之间差异具有统计学意义(t=-12.858,P=0.006)。ABCtransporter家族与SP表型密切相关,特别是MDR1-Pgp和ABCG2, Western blot结果示SGC-7901细胞中MDR1-Pgp与ABCG2均不表达,而SGC-7901/VCR细胞不表达ABCG2,而是高表达MDR1-Pgp.在MDR1-Pgp的表达上,SGC-7901与SGC-7901/VCR细胞具有明显的差异。(2).流式检测SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞中CD44+细胞比例分别为95.400+3.400%和95.433±2.139%,均高表达CD44+细胞,没有显著差异(t=-0.014,P=0.989)。而EpCAM+细胞比例分别为22.733+2.554%和93.667+4.723%,两者之间的差异具有统计学意义(t=-22.883,P=0.000)。(3).SGC-7901与SGC-7901/VCR细胞在无血清培养基中培养30天以后发现SGC-7901细胞不形成或形成较小的肿瘤球,SGC-7901/VCR细胞形成较大的肿瘤球。每1000个SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞形成的肿瘤球个数分别为0和36.000±5.568个,两者之间具有明显的差异,差异具有统计学意义(t=-11.199,p=0.000)。Western blot实验结果发现,在SGC-7901细胞表达只表达C-myc,而SGC-7901/VCR细胞表达Nanog和C-myc o在C-myc的表达上,SGC-7901与SGC-7901/VCR细胞没有差异；在Nanog的表达上,两者具有明显的差异。3.盐霉素逆转SGC-7901/VCR多药耐药及其机制的研究(1).MTT检测盐霉素对SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞的剂量效应,IC50分别为1.755±0.182gM和2.480±0.174μM,具有统计学差异(t=-4.978,P=0.008)。经1μM、2μM和4μM盐霉素作用后,检测SGC-7901/VCR细胞对VCR的IC50分别为0.710±0.060μM、0.410±0.040μM和0.210±0.020gM,与未处理组(0μM)相比,均具有显著差异(P<0.05)。逆转指数分别为3.420、5.930和11.57。MDRexfflux assay证实盐霉素能增加SGC-7901/VCR细胞内多柔比星的浓度,而且这种作用具有浓度依赖性。(2).在Oμ.M、1μM、2μM和4gM盐霉素作用后,SGC-7901细胞的凋亡率分别为1.700±1.300%、21.433±4.496%、58.800±4.331%和79.800±3.869%,SGC-7901/VCR细胞的凋亡率分别为1.767±1.850%、21.033±5.804%、58.200±6.596%和81.233±3.037%。所以,随着盐霉素浓度的增加,SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞的凋亡率都随之增加(F=417.850,P=0.000),相同药物浓度下两细胞的凋亡率没有差异(F=0.069,P=0.976)。(3). SGC-7901/VCR细胞经不同浓度盐霉素(OμM、1μM、2μM和4μM)作用48h后,收集细胞行SP检测,发现SP比例随着盐霉素浓度的增加逐渐降低,分别为93.733±6.351%、54.967±5.784%、30.567±4.92%和11.700±2.663%(F=128.332,P=0.000),而MDR1-Pgp的表达量也随之逐渐降低。(4). SGC-7901/VCR细胞经不同浓度盐霉素OμM、1μM、2μM和4μM处理48h后,继续在无血清培养基下培养肿瘤球,约30d后发现,随着药物浓度逐渐增加,肿瘤球的形成逐渐受到抑制,而且肿瘤球的大小也随之变小。干细胞因子Nanog表达量也随之降低。(5).盐霉素可降低SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞EpCAM+细胞的比例,两细胞经不同浓度盐霉素(0μM、1μM、2μM和4gM)作用48h后,流式检测EpCAM+细胞的比例分别为：26.667+2.616%、20.600+4.444%、66.667+1.242%和2.767±0.603%；90.500±5.839%、57.067±6.467%、21.567±6.048%和7.900±4.158%。随着药物浓度的增加,每种细胞各个处理组之间均具有显著差异(F=177.240,P=0.000)。结论1.与亲代细胞SGC-7901相比,耐药细胞SGC-7901/VCR具有多药耐药,增殖速度快,体内致瘤能力强,而且肿瘤干细胞增加等特点。其耐药主要与MDR1-Pgp过表达以及肿瘤干细胞增加等相关。2.盐霉素在体外通过抑制肿瘤干细胞,降低耐药蛋白MDR1/Pgp,诱导凋亡等可逆转SGC-7901/VCR的多药耐药。