研究目的：研究驱动蛋白KIF4在胃癌组织的表达情况及对胃癌细胞BGC增殖的影响。同时研究KIF4对卵巢癌细胞SK-OV-3迁移的影响。为阐明KIF4在肿瘤发生发展中的作用奠定基础,同时也为探索新的肿瘤生物治疗方法提供帮助。研究方法：一、驱动蛋白KIF4在胃癌组织中的表达情况1、免疫组织化学染色实验比较KIF4在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况本研究中23例原发性胃癌病人于2006-2008年间在山东大学齐鲁医院接受外科手术,手术之后,肿瘤样本和它相应的癌旁组织用石蜡包埋,室温储存。石蜡包埋的标本组织被切成4-5μm,放置至载玻片上。羊血清封闭后,抗KIF4的多克隆抗体以1：500稀释,加至载玻片上。免疫染色用晶美生物技术公司的Histostain-Plus试剂盒,过程参照说明书。阴性对照用PBS溶液代替一抗。每张标本用奥林帕斯IX81倒置显微镜随机拍取5张照片。照片的累积光密度用Image-Pro Plus6.0软件进行分析。2、统计分析KIF4的表达量与临床资料的相关性用SPSS11.0进行统计学数据分析。每一个实验的结果用平均值±标准差来描述。用双侧t检验来比较实验组和对照组。用列联表来分析KIF4的表达与胃癌病人的病理学变量的关系。二、驱动蛋白KIF4对胃癌细胞BGC增殖的影响1、筛选稳定表达GFP-KIF4的BGC细胞株(BGC-GFP-KIF4)及稳定表达GFP的BGC细胞株(BGC-GFP)(1)真核表达载体pEGFP-KIF4的构建PCR扩增产生的KIF4编码区域通过BglⅡ-SalⅠ双酶切位点克隆至真核表达载体pEGFP-C1。(2)转染pEGFP-KIF4质粒或pEGFP质粒至BGC细胞取生长良好的BGC细胞,按3×104／孔接种到24孔板,培养过夜。用脂质体2000将0.5μg pEGFP-KIF4或pEGFP质粒转染入细胞。2天后,细胞转移入10cm平皿,在含1mg／mlG418的完全培养基中培养,每隔3天换一次液。2到3周后,在倒置荧光显微镜下挑选出单个阳性克隆,继续在1mg／mlG418的完全培养基中培养。最后,稳定表达GFP-KIF4或GFP的BGC细胞被筛选出来,通过Western blot进行检测。(3) Western blot检测GFP-KIF4在稳筛细胞株中的表达离心收集细胞,用裂解液(50mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,0.5% NP-40, 0.5%dexycholate-Na,0.1% SDS, protease inhibitor cocktail)裂解细胞。40μg总蛋白通过12%SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移至PVDF膜。兔抗KIF4的抗体1：1000稀释来检测内源性KIF4和表达的GFP-KIF4融合蛋白。鼠抗Tubulin的单克隆抗体1：1000倍稀释,来显示微管蛋白作为内参。随后加入HRP标记的羊抗兔／鼠IgG的二抗,最后用ECL发光系统显色。2、免疫荧光染色显示过表达KIF4引起的细胞多核性生长在盖玻片上的稳筛细胞株用冷甲醇室温固定5min,然后用含5%羊血清、0.3%TritonX-100的PBS封闭。一抗用鼠抗Tubulin的抗体(1：10000稀释),二抗用TexasRed交联的羊抗鼠的抗体(1：10000稀释),分别染色2h。DNA用DAPI(1μg/ml)染色5min。PBS洗后,用FluoroGuard抗淬灭剂将盖玻片固定在干净的载玻片上,指甲油封边。3、细胞增殖计数及MTT检测过表达KIF4对BGC增殖的影响将两种稳筛细胞株接种于24孔板中,每孔500μl细胞悬液中含5000个细胞,置培养箱中培养。在接下来的9天内,每隔一天计数细胞数量。根据数据绘制细胞生长曲线。将两种稳筛细胞株接种于96孔板中,每孔200μl细胞悬液中含5000个细胞,置培养箱中培养。在接下来的9天内,每隔一天采用MTT法检测细胞增殖情况。每孔加入20μl 5mg／mlMTT,继续培养4个小时。然后去除细胞培养基,加入200μlDMSO,20min后,在酶标仪上570nm测量吸光度值。根据数据绘制曲线。4、克隆形成实验检测过表达KIF4对BGC增殖的影响在35mm平皿中铺入2ml含0.6%琼脂的培养基,室温下凝固作为下层胶。1×104个细胞加入1ml含0.3%琼脂的培养基中,作为上层胶。培养3周后,用0.05%结晶紫染色细胞30min。拍摄照片并用Image-Pro Plus6.0进行克隆计数。5、裸鼠体内成瘤检测过表达KIF4对BGC成瘤性的影响实验用的雌性BABL／c小鼠(6-8周大)从中国科学院上海实验动物中心购进。取4×106个BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP细胞和100 gMatrigel接种到无胸腺小鼠(nu／nu)的左腋下。每组5只。肿瘤的大小每周用游标卡尺进行测量。肿瘤的体积通过下列公式计算：体积=(长×宽2)／2。7周后,脱颈法处死小鼠,从小鼠体内取出肿瘤组织测量体积和称重并照相。6、统计分析使用SPSS16.0软件进行统计学分析。对正态分布的配对数据进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。三、驱动蛋白KIF4对卵巢癌SK-OV-3迁移能力的影响1.筛选稳定低表达KIF4的SK-OV-3细胞株(1) pGPU6/GFP/Neo-KIF4质粒及pGPU6/GFP/Neo-NC质粒的构建于文献资料中检索到KIF4的siRNA序列,它是针对KIF4的19nt的RNA片段。序列为5’GCAGATTGAAAGCCTAGAG3’.将此片段补充设计为shDNA,并克隆入pGPU6/GFP/Neo载体,命名为pGPU6/GFP/Neo-KIF4。阴性对照干扰序列为5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。将此片段补充设计为shDNA,并克隆入pGPU6／GFP／Neo载体,命名为pGPU6／GFP／Neo-NC。(2)转染pGPU6/GFP/Neo-KIF4质粒及pGPU6/GFP/Neo-NC质粒至SK-OV-3细胞人卵巢癌细胞SK-OV-3用含10%胎牛血清的RPMI-1640,于37℃、5%C02的条件下培养,每周传代2-3次。当SK-OV-3培养至对数生长期,用0.25%胰酶消化,按每孔3×104／400μL接种于24孔板,次日当细胞融合率达70%左右时,用Lipofectamine2000分别转染pGPU6/GFP/Neo-KIF4及pGPU6/GFP/Neo-NC。每孔质粒：脂质体=0.5μg：0.5μL。用无血清RPMI-1640培养基50μL稀释脂质体0.5μL,室温静置5min。无血清RPMI-1640培养基50μL稀释质粒0.5gg,室温静置5min。混合上述液体,室温静置20min。将混合液100μL加入24孔板细胞中,轻摇混匀。转染4-6h后更换成含10%胎牛血清的新鲜培养基,继续培养。48h后将孔板中的细胞消化,转入10cm平皿中,用含1mg／mLG418的培养基进行筛选,隔3d换液,待形成阳性单克隆后,用枪头吸取细胞培养。转染pGPU6/GFP/Neo-NC的阳性克隆命名为NC对照组,转染pGPU6/GFP/Neo-KIF4的阳性克隆分别命名为KIF4敲除组1、KIF4敲除组2。(3) Western blot检测KIF4的敲除情况每组收集1×106个细胞,用RIPA裂解液冰上裂解40min,4℃最高速离心后取上清。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定,取50μg总蛋白上样。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶、稳流30mA、1.5h,电泳分离蛋白质。400mA,2h,转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1h,以兔抗KIF4抗体(1：1000)孵育2h,辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗(1：10000)1h,用ECL发光系统检测,暗室内X胶片显影。2、低表达KIF4对卵巢癌细胞SK-OV-3迁移能力的影响(1)细胞迁移实验将细胞分为4组：SK-OV-3组、NC对照组、KIF4敲除组1、KIF4敲除组2。每组设3个复孔,在8μm孔径的Transwell小室中进行实验。取对数生长期的细胞,用0.25%胰酶消化,无血清RPMI-1640洗涤细胞两次,计数1×105／100μL个细胞,种于上室。下室加600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37℃、5%CO2培养22h。取出上室,PBS洗涤小室上下部2次,甲醇固定10min。1%伊红染色5min。PBS洗涤后,用棉签擦去上室面的细胞。小心用刀片将膜从小室上切下,膜下室面朝上置于载玻片上,干燥后,中性树胶封固。显微镜下观察。每组3个复孔中的每个孔于显微镜下随机选取5个视野拍照。用Image-Pro Plus 6.0进行计数分析。(2)统计学处理使用SPSS16.0软件进行统计学分析。对正态分布的配对数据进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果一、驱动蛋白KIF4在胃癌组织中的表达情况1、驱动蛋白KIF4在胃癌中表达降低免疫组织化学检测了23例胃癌样本及相应的癌旁组织。KIF4的表达水平根据免疫组化染色实验分成8级。结果显示,23例中有13(56.5%)例呈现癌组织比癌旁组织低表达。应用Image-Pro Plus6.0软件,测量样本KIF4染色的累积光密度,发现所有癌旁组织的累积光密度比癌组织要高4倍。2、KIF4在胃癌组织中表达降低与胃癌分化有相关性我们接下来研究KIF4的表达和临床病理特征,临床档案资料之间的联系。结果显示KIF4的低表达和胃癌的低分化之间有显著相关性。在19例低分化的胃癌中,13例呈现出KIF4在癌组织中较癌旁组织中低表达。但是,4例中分化的肿瘤样本中,没有一例癌组织比癌旁组织KIF4低表达。所有结果表明,驱动蛋白KIF4在胃癌组织中低表达,且表达程度与肿瘤分化级别密切相关。二、驱动蛋白KIF4对胃癌细胞BGC增殖的影响1、成功筛选稳定表达GFP-KIF4的BGC细胞株(BGC-GFP-KIF4)及稳定表达GFP的BGC细胞株(BGC-GFP)(1)成功构建融合表达载体pEGFP-KIF4重组质粒双酶切后电泳,获得的目的基因片段与预期大小一致。DNA测序证明重组载体pEGFP-KIF4构建成功。(2)转染pEGFP-KIF4质粒或pEGFP质粒至BGC细胞转染质粒至细胞中,2天后,荧光比率可达约80%。转入10cm平皿培养2-3周后,挑取荧光较强的单克隆进行培养。(3) Western blot检测GFP-KIF4或GFP在稳筛细胞中的表达Western blot结果显示pEGFP-KIF4转染的BGC细胞中有明显的特异性条带,而转染空质粒和空细胞的对照组均未见条带,表明重组质粒可在BGC细胞中表达外源KIF4即GFP-KIF4。2、免疫荧光染色显示过表达KIF4引起细胞多核性在BGC-GFP-KIF4细胞中存在比BGC-GFP细胞中更多的多核细胞。在BGC-GFP-KIF4细胞中有14.5±0.82%的多核细胞,而在BGC-GFP中只有4.4±0.46%,与BGC细胞中相似。3、细胞增殖计数及MTT表明过表达KIF4对BGC增殖有抑制作用细胞增殖计数及MTT每隔一天检测一次,一共持续9天。结果显示,前3天内,两株细胞间没有显著的差别。但是从第5天开始,BGC-GFP-KIF4相对于BGC-GFP和BGC细胞来说,增殖显著抑制。而在BGC-GFP和BGC之间没有增殖效率的不同,说明在BGC细胞表达GFP不会影响细胞的增殖。4、克隆形成实验表明过表达KIF4对BGC增殖有抑制作用为了检验细胞在不贴壁情况下的生存能力,利用软琼脂克隆形成实验来检测两种细胞系。1×104个细胞种植在35mm的软琼脂培养基中。3周后,细胞用结晶紫染色后拍照。计数细胞克隆。在BGC-GFP中有平均143±9个细胞克隆,而在BGC-GFP-KIF4中只有30±9个细胞克隆。这些结果说明在细胞不贴壁的情况下,当在BGC中过表达KIF4,细胞增殖被显著抑制。5、裸鼠体内成瘤表明过表达KIF4对BGC成瘤性的抑制作用4×106个BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP细胞接种到无胸腺裸鼠的左腋下(每组5只),每周测量记录肿瘤大小,测量7周。由BGC-GFP-KIF4衍生出的肿瘤比BGC-GFP衍生出的生长缓慢很多。7周后,所有小鼠处死,分离肿瘤。然后将肿瘤样本称重并拍照。BG-GFP-KIF4生长出的肿瘤的平均重量(0.9±0.24g)显著低于BGC-GFP生长出的肿瘤(3.0±1.17g),大约要轻3倍。这些结果都表明,BGC-GFP-KIF4在裸鼠形成肿瘤的能力相对于BGC-GFP来说要弱很多。表明在BGC细胞过表达KIF4可抑制体内肿瘤的形成。三、驱动蛋白KIF4对卵巢癌SK-OV-3迁移能力的影响1、筛选稳定低表达KIF4的SK-OV-3细胞株(1) pGPU6/GFP/Neo-KIF4质粒及pGPU6/GFP/Neo-NC质粒的构建重组质粒双酶切后电泳,获得的目的基因片段与预期大小一致。DNA测序证明重组载体pGPU6/GFP/Neo-KIF4及pGPU6/GFP/Neo-NC构建成功。(2)细胞培养及转染pGPU6/GFP/Neo-NC及pGPU6/GFP/Neo-KIF4中含有编码绿色荧光蛋白GFP的基因,经细胞瞬时转染和G418稳定筛选后,稳筛成功的细胞在荧光显微镜下观察可发出绿色荧光,绿色荧光比率均可达到92%以上。(3)免疫印迹法检测KIF4的表达免疫印迹结果显示,与转染pGPU6/GFP/Neo-NC的NC对照组相比,转染pGPU6/GFP/Neo-KIF4质粒的阳性稳筛细胞株能显著抑制KIF4蛋白表达。2、细胞迁移实验SK-OV-3组、NC对照组、KIF4敲除组1、KIF4敲除组2下室面细胞平均数分别为122、112、298、312。KIF4敲除组迁移到下室面的细胞数明显多于SK-OV-3组和NC对照组,可达大约3倍。结论及意义：1.本研究成功构建了一个过表达质粒pEGFP-KIF4和两个敲除质粒pGPU6/GFP/Neo-KIF4及pGPU6/GFP/Neo-NC,三种载体的构建为进一步研究KIF4的功能提供了必要的条件。2.本研究表明驱动蛋白KIF4在胃癌中表达降低,且与胃癌分化有相关性。为胃癌发病机制的研究奠定了基础,也为下一步的细胞水平实验指明了方向。3.本研究证明在胃癌细胞BGC中过表达KIF4可抑制BGC的增殖和体内成瘤,为进一步深入研究KIF4功能奠定了基础,同时也为发现胃癌治疗新靶点提供实验依据。4.本研究证明在SK-OV-3中低表达KIF4可使细胞迁移能力增强,为进一步研究KIF4在细胞迁移中的作用奠定了基础。