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目的：
糖尿病肾病(diabetic kidney desease,DKD)是糖尿病(diabetic mellitus,DM)的常见微血管并发症,是终术期肾功能衰竭的主要原因之一。DKD的发病机制目前尚未完全明了。DKD病理表现早期主要表现为：肾小球系膜细胞肥大、增生、细胞外基质(extro-cellular matrix,ECM)集聚,纤连蛋白(fibronectin,FN)是ECM的重要组成成分。晚期主要表现。肾小球硬化、纤维化以及肾小管间质纤维化。肾小球系膜细胞肥大、增生在ECM的集聚和后期的肾小球硬化中起主导作用。高糖可诱导人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)的肥大、增生、ECM集聚,乃至纤维化。高糖也可诱导肾脏的炎症反应进而加重DKD。
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种敏感的急性时相蛋白。近年发现SAA能够影响DKD的发生和发展。但在DKD病变中SAA与ECM及炎症反应的关系尚有许多未知。本实验研究SAA-siRNA干扰对高糖条件培养下的HMCs炎症反应及ECM的影响,探讨SAA在DKD发生发展中的作用。
实验方法：
一、细胞培养和计数
将冻存的HMCs株投入37℃温水中,摇动使尽快解冻。吸出细胞悬液并加入含10％胎牛血清改良型RPMI-1640培养液10ml,混匀,1000转/min离心5min,弃上清用MCM-4201培养基稀释混匀,接种于培养瓶中,37℃5％CO2孵箱中孵育,细胞贴壁后隔同换液,3-5天长满并融合成单层,用0.25％胰蛋白酶消化,传代比例为1:2,取对数生长期细胞,计数细胞后调整细胞数接种于6孔培养板中待细胞均匀铺满容器底面70-80％后,分组实验。
二、实验分组
将上述培养细胞更换Opti-MEM培养基中培养24小时,使细胞同步化,然后分6组:(1)正常对照组(NG,含葡萄糖5.5mM):(2)高糖组(HG,含葡萄糖30raM);(3)等渗对照组(Man+NG,含5.5mM葡萄糖及24.5mM甘露醇);(4)高糖+脂质体对照组(HG+Lipo)(5)高糖+阴性转染对照组(HG+neg-siRNA);(6)高糖+SAA-siRNA组(HG+SAA-siRNA)。37℃5％CO2孵箱中孵育48h。分别于0h,12h,24h,48h收集上清,48h收集细胞进行实验。
三、siRNA合成与转染
根据GenBank数据库提供的人SAA全长基因,脂质体瞬时转染方法转染细胞,以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)标记的siRNA做对照,转染48h后在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达,计算转染效率。
四、real-time PCR检测mRNA表达
TRIzol提取细胞总RNA,测OD260/OD280,计算RNA浓度。取2ug RNA逆转录为cDNA,取cDNA2ul进行PCR扩增。采用SYBRGreen嵌合荧光进行反应,按说明书配制25μl的反应体系,95℃预变性30s,95℃变性5s,55-60℃退火30s,72℃延伸30s同时获取荧光,共40个循环,后行产物的溶解曲线分析,得到样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-AACt表示基因的相对表达量。
五、Elisa检测蛋白表达
从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,除外空白孔,分别将标本(标准品)50ul/孔加入,封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育30min。沈板4次,甩净孔内液体,每孔加洗涤液350ul,静置30sec甩净,在厚叠吸水纸上拍干。加入生物素化抗体工作液,封口膜封住反应孔37℃孵育30min,洗板,空白孔外加入酶结合物工作液(50ul/孔),封住反应孔,37℃孵育30min,沈板,加入显色剂37℃孵育15min,加入终止液,测OD450值。
六、统计学处理
所有数据以-x±S表示,采用SPSS17.0统计分析软件,组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD,Dunnetts T3,P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
一、siRNA转染率
GFP标记的siRNA转染48h后在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达,转染效率达80％。
二、real-time PCR检测mRNA表达结果
按照上述分组转染HMCs,高糖继续培养48h后,HG组较NG组SAA,TNF-αmRNA的表达明显升高(P＜0.05),作为对照组的HG+Lipo和HG+neg-siRNA组各基因表达量与HG组相比,差异没有统计学意义(P＞0.05),利用SAA-siRNA转染后,高糖继续培养48h,发现SAA-siRNA组与HG组相比差异有统计学意义(P＜0.05)
三、Elisa检测蛋白表达结果
HMCs经高糖培养后,上清液中SAA,FN,TNF-α的含量于12h开始升高,48h明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。各个时间点与NG组相比,各蛋白的表达均明显升高(P＜0.05)。HG+Lipo及HG+neg-siRNA与HG组相比,差异均没有统计学意义(P＞0.05)。经SAA-siRNA干扰后,细胞上清中各蛋白的含量均有明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)
结论：
SAA是高糖诱导HMCs分泌ECM的重要介质,通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制SAA的表达,可减少高糖刺激下。肾小球系膜细胞FN,TNF-α的分泌,减少肾小球ECM的积聚及肾小球炎症反应,为DKD的防治提供了新的靶点。