本研究得出结论:瑞芬太尼能够引起大鼠痛觉超敏,表现为热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值降低,甚至单独瑞芬太尼注射引起的痛觉超敏比单独外科操作引起的痛觉超敏更甚,无论是瑞芬太尼输注,还是手术刺激,都可以引起腰段脊髓c-fos表达的增加。NMDA受体拮抗剂氯胺酮和硫酸镁均可以在一定程度上抑制瑞芬太尼引起的痛觉超敏。氯胺酮在抑制热超敏阈值和机械刺激痛阈值要强于硫酸镁,无论是氯胺酮还是硫酸镁,在抑制痛觉超敏上均呈剂量依赖性相关。在首次给予NMDA受体拮抗剂1周以后的二次瑞芬太尼再次暴露中,无论是氯胺酮还是硫酸镁,1周以前给予的量均无法抑制瑞芬太尼再次暴露引起的痛觉超敏。NMDA受体NR2B亚基在瑞芬太尼的痛觉超敏中起到重要作用,NMDA受体拮抗剂可以抑制NR2B亚基的磷酸化。在接下去的研究中我们发现,瑞芬太尼可以引起Wnt/β-catenin的活化,引起wnt3和wnt5,以及下游分子β-catenin的表达增长。NMDA受体NR2B亚基拮抗剂Ro25-8961和wnt清除剂iwp-2可以通过抑制wnt活化,减少瑞芬太尼输注后脊髓背角神经元wnt表达,抑制wnt通路下游的分子表达,抑制瑞芬太尼痛觉超敏,免疫荧光显示虽然wnt清除剂iwp-2可以抑制更少的wnt3表达,但是在行为学测试上,无论是热痛觉阈值,还是机械痛刺激阈值,Ro25-8961均比iwp-2在抑制痛觉超敏上有优势,提示Wnt/β-catenin参与了瑞芬太尼痛觉超敏,但是可能不是唯一的通路。本研究采用行为学、Western-Blot、免疫组化等方法,在分子(NMDA受体NR2B亚基)、细胞(脊髓背角神经元)和整体(感觉系统)水平探讨瑞芬太尼引起痛觉超敏的神经机制。第一部分:建立瑞芬太尼引起大鼠痛觉超敏的动物模型目的:探讨瑞芬太尼输注后对大鼠痛觉超敏的影响。建立瑞芬太尼引起大鼠痛觉超敏的动物模型。方法:24只SD大鼠,根据目的进行分成4组:空白对照组,单纯外科手术组,单纯瑞芬太尼组,瑞芬太尼复合手术组,并通过行为学、分子学(western-blot测量NR2B含量),c-fos进行以下研究:观察瑞芬太尼输注后对大鼠行为学的影响,包括热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值的测量,通过大鼠体内c-fos含量和活化的NR2B亚基含量的变化。结果:与外科操作相比,瑞芬太尼组大鼠术后6小时(p=0.02),24小时(p=0.02),48小时(p=0.02)的热痛觉过敏阈值,术后6小时(p=0.02),24小时(p=0.02),48小时(p=0.02)的机械性触敏诱发痛阈值明显较低,瑞芬太尼输注后cfos含量与外科操作相比没有差异,瑞芬太尼联合外科操作的c-fos含量最高,热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值也最低。结论:瑞芬太尼联合外科操作可以引起最严重的痛觉超敏,c-fos含量也最高,有意思的是,单纯瑞芬太尼输注引起的热超敏比单纯外科操作更甚,其余指标,单纯瑞芬太尼输注和单纯外科操作两者没有差别。第二部分:NMDA受体拮抗剂氯胺酮,硫酸镁对大鼠瑞芬太尼输注导致痛觉超敏的影响目的:NMDA受体的活化在瑞芬太尼痛觉超敏中起到重要的作用,我们推测椎管内给予NMDA受体拮抗剂氯胺酮,硫酸镁可以减缓大鼠的热痛敏和机械性触敏诱发痛阈值。方法:48只SD大鼠,根据目的进行分成4组:空白对照组,瑞芬太尼痛觉超敏模型组,氯胺酮组(椎管内给予10μg氯胺酮),硫酸镁300组(椎管内给予300μg硫酸镁),硫酸镁100组(椎管内给予100μg硫酸镁),并通过行为学、分子学(western-blot测量NR2B含量),c-fos进行以下研究:观察瑞芬太尼输注后对大鼠行为学的影响,包括记录术前-24 h,术后2 h,6 h,24 h,48 h,72 h以及7天后的热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值的测量,通过大鼠体内c-fos含量和活化的NR2B亚基含量的变化,7天后再次给予瑞芬太尼二次暴露,进行行为学评价。结果:无论是氯胺酮,还是硫酸镁(100,300μg),都可以剂量依赖性的抑制瑞芬太尼输注导致的痛觉超敏,抑制热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值的下降,与300μg硫酸镁组相比,氯胺酮组能更好的抑制6h(p=0.018),24 h(p=0.014)and 48 h(p=0.011)时的机械性触敏诱发痛超敏,在热超敏上,300μg硫酸镁与氯胺酮组无差异。在首次给予NMDA受体拮抗剂1周以后的二次瑞芬太尼再次暴露中,无论是氯胺酮还是硫酸镁,1周以前给予的量均无法抑制瑞芬太尼再次暴露引起的痛觉超敏。瑞芬太尼可以明显使NR2B磷酸化水平增强,硫酸镁可以很好的剂量相关性的抑制腰段脊髓NR2B磷酸化结论:NMDA受体拮抗剂(氯胺酮和硫酸镁),都可以剂量依赖性的抑制瑞芬太尼输注导致的痛觉超敏。在首次给予NMDA受体拮抗剂1周以后的二次瑞芬太尼再次暴露中,无论是氯胺酮还是硫酸镁,1周以前给予的量均无法抑制瑞芬太尼一周以后再次暴露引起的痛觉超敏。我们可以通过镁离子介导的NMDA受体阻断,也可以通过氯胺酮抑制瑞芬太尼痛觉超敏,这给我们治疗临床上常见的瑞芬太尼痛觉超敏提供了新的思路。第三部分:瑞芬太尼输注对wnt/β-catenin-NMDA信号通路的影响目的:探讨wnt/β-catenin通路对瑞芬太尼痛觉超敏的影响。方法:采用SD大鼠,根据目的分成4组:空白对照组,瑞芬太尼痛觉超敏模型组,NR2B亚基Ro25-8961(100μg),wnt清除剂iwp-2组(20u M),并通过行为学(n=8)、分子学(western-blot测量NR2B含量,wnt3含量),进行以下研究:观察瑞芬太尼输注后wnt/β-catenin通路的影响,包括热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值的测量,测量大鼠腰段脊髓活化的NR2B亚基含量以及wnt3的含量,对脊髓背角进行免疫荧光染色定位。结果:瑞芬太尼可以明显增强wnt3和wnt5的表达,与瑞芬太尼痛觉超敏模型组相比,NR2B亚基拮抗剂Ro25-8961可以明显减少腰段脊髓背角活化wnt3的含量,并减少wnt亚基及其下游β-catenin的表达,wnt清除剂iwp-2也可以减少脊髓背角wnt的表达,减少NR2B的含量,但是在行为学指标上,iwp-2抑制热痛觉过敏阈值和机械性触敏诱发痛阈值的能力弱于Ro25-8961组。免疫荧光检查发现瑞芬太尼可以明显增强脊髓背角wnt3的表达。与瑞芬太尼处理组相比,iwp-2和Ro25-8961均可以明显减少脊髓背角细胞活化wnt3的含量。结论:瑞芬太尼可以活化wnt/β-catenin通路,Ro25-8961通过部分抑制wnt/β-catenin通路,减少痛觉超敏,减少NR2B亚基磷酸化,iwp-2可以通过抑制wnt/β-catenin通路,抑制NR2B的磷酸化,但是在减少痛觉超敏的行为学试验上,Ro25-8961更有优势。瑞芬太尼引起脊髓背角的wnt3高表达,给予iwp-2和Ro25-8961可以有效抑制脊髓背角的wnt3积聚。