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年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种严重损害老年人视力的进行性疾病，通常双眼先后发病，多发生于50岁以上老年人。主要表现为视物变形、中心暗点、对比度下降以及视野缩小等，早期眼底多表现为色素紊乱和玻璃膜疣生成，一般不引起视力变化；晚期眼底新生血管生成，引起视力下降。迄今为止，关于AMD发病机制进行了大量的基础以及临床研究，但发病机制并不十分清楚，多数情况下认为其是一种多因素疾病，受到环境、个体因素等多方面影响，同时与基因相关，因此也缺乏有效治疗方法。近年来，关于氧化应激在AMD发病过程中的作用日益研究深入。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogenspecies，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。正常情况下机体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，对机体无有害影响。而多种内源性及外源性有害刺激可以打破这种平衡，致活性氧大量生成，超过抗氧化系统的清除能力，机体即形成氧化应激状态，引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，产生细胞毒效应并最终对机体造成不可逆损害。细胞凋亡在机体生长发育和衰老等许多病理生理过程中起重要作用。触发凋亡的因素包括衰老、病毒感染和氧化性损伤等。研究发现，活性氧所致的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节。视网膜光感受器外节膜盘富含多不饱和脂肪酸，极易受到氧化损伤的攻击，而后启动细胞溶解链发生。AMD早期，视网膜色素上皮（retinal pigmentepithelium，RPE）细胞随年龄增长负担加重，RPE吞噬溶酶体过程中发生光感受器碎片酶的降解，降解物为未完全消化的不能溶解聚集物形式，称作脂质，脂质由不同分子混合而成，包括视网膜诱导复合物，其中一些具有光诱导性质，可增强氧化应激损伤，脂质堆积在细胞内，干扰RPE细胞的代谢，造成代谢产物堆积于Bruch膜上，导致氧弥散障碍，诱发新生血管；而脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）主要由RPE产生，参与RPE与脉络膜毛细血管之间的旁分泌信号转导。RPE位于神经视网膜和脉络膜之间，通过提供营养和代谢废物来滋养视网膜，成为血视网膜屏障的外层，控制着视网膜下间隙的化学成分，其顶面细胞膜与细胞外基质相连，在早期胚胎发育过程中，RPE自发转分化为神经视网膜组织，在其邻近的光感受器发育和维持中起重要作用，光照条件下RPE可产生大量活性氧。视网膜本身具有对抗氧化应激损伤机制，可有效中和ROS损伤。抗氧化酶在此过程中发挥重要作用，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH）和谷胱甘肽转硫酶（glutathione S-transferase, GST）等。基于以上研究，本实验收集AMD患者临床血液标本，进行体内抗氧化酶水平的检测，同时，在细胞水平利用H2O2模拟体内氧化应激状态，研究抗氧化酶水平的表达变化情况，观察H2O2对RPE细胞损伤程度的影响，分析RPE细胞相关保护作用，并对其可能机制进行了初步探讨。其主要结果如下：一AMD患者血浆内抗氧化酶变化：AMD患者组GST水平（76.96U/L）显著高于对照组（62.74U/L），而GSH水平（61.38mgGSH/L）低于对照组（81.33mgGSH/L）；SOD在AMD患者组和正常对照组水平分别为64.47U/L和62.53U/L。两组相比GST和GSH活力具有统计学意义（Z=﹣2.082，P=0.037；Z=﹣2.900，P=0.004），两组间SOD水平差异无统计学意义（Z=﹣0.090，P=0.725）。低水平的GSH是AMD患病危险因素。AMD患者血浆中GST水平升高，提示AMD患者处于氧化应激状态，GSH水平降低使AMD患者更易受到氧化应激损伤的攻击。二氧化应激状态下RPE形态学变化：荧光显微镜下正常RPE细胞核呈均匀弥散荧光。经过H2O2处理后，可观察到RPE细胞膜完整，细胞核浓聚深染，核内荧光致密，由匀质状态固缩成高凝集的点状结构，出现典型的凋亡形态。经过Vit C预处理的RPE细胞，再经H2O2刺激24h后，核固缩数目减少，染色质边聚和核碎片减少。三RPE细胞活力变化：不同浓度H2O2预处理RPE细胞24h后，细胞活性明显下降，其中，400μmol/L以上浓度H2O2刺激后细胞活力与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度Vit C处理RPE细胞后24h，细胞活力明显增加，各浓度组与对照组相比均具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度VitC预处理RPE细胞4h后，用单浓度H2O2继续处理RPE细胞24h，与对照组相比，经过150μmol/L以上浓度Vit C处理的细胞其活性较未处理细胞活性明显升高，具有统计学意义（P＜0.05）；经单浓度Vit C处理RPE细胞4h后，再对RPE细胞行不同浓度H2O2刺激24h，与对照组相比，经过不同浓度Vit C处理的RPE细胞活性升高明显。四氧化应激状态下RPE细胞内抗氧化酶水平变化：H2O2预处理RPE细胞24h后，胞内SOD、GST和GSH水平均下降；维生素C（vitamine C,Vit C）处理RPE细胞后胞内SOD、GST和GSH水平均升高；经Vit C预处理后再接受H2O2刺激的RPE细胞胞内SOD、GST和GSH水平相较单纯H2O2刺激后水平升高。五Vit C保护作用机制：Western blot结果显示，Vit C和H2O2处理细胞后显著增加了phospho-ERK1/ERK2水平，而PD98059（ERK1/ERK2抑制剂）则抑制phospho-ERK1/ERK2的上调。细胞活力检测结果显示PD98059明显抑制了Vit C保护RPE细胞免受H2O2刺激的能力，说明Vit C通过phospho-ERK1/ERK2通路对RPE细胞起保护作用。总之，通过本实验研究证明，AMD患者血浆中抗氧化酶GST水平升高，患者处于氧化应激状态，GSH水平降低，降低的GSH水平使AMD患者更易于受到氧化应激损伤攻击，低水平的GSH是AMD发病的危险因素；细胞水平证实氧化应激状态下胞内三种抗氧化酶活性均下降，经过氧化剂Vit C处理的细胞其胞内抗氧化酶活性升高，可有效保护RPE细胞免受氧化应激损伤引起的凋亡。同时，GSH活力在血浆中降低而在RPE细胞胞内升高，推测在氧化应激状态下，GSH仅在眼局部发挥作用，这一结果需要更多大量的研究来证实。在上述实验研究的基础上，进一步的研究重点在于更多样本量的观察研究，包括寻找其可能的保护机制及原因，为临床治疗AMD提供新的方法与方向。