大肠杆菌 Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德国医生 Alfred Nissle 于1917年在腹泻流行疫区一名抗腹泻士兵肠道粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区腹泻的侵扰。大肠杆菌Nissle1917是一株无致病性的益生菌,能赋予不同宿主健康益处,且至今并未发现对宿主有已知的害处和不利影响。在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为医用Mutaflor(?)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来临床应用上,益生菌Nissle1917菌株作为疾病诊治载体被加以改造的报道越来越多,该益生菌已用于疫苗、肿瘤治疗、保健品和诊断制剂等多方面产品的开发与研制。EcNc(EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 andpMUT2;EcNc)克隆株为大肠杆菌Nissle1917原型野生株改造后去除其胞内两个隐秘性质粒pMUT1和pMUT2,具有比原型亲本株能够携带更多(大)容量的同源或外源基因的特性,该菌株已在本实验室前提研究中制备获得。为了实现微生物中同源或异源蛋白的过量表达生产,大多利用多拷贝质粒的过表达,这种方法由于易于操作和易于调控表达异源蛋白而被广泛使用,但这种方法存在遗传不稳定性。鉴于质粒多拷贝复制,筛选所用抗生素抗性基因的过量表达以及异源基因高表达等因素所带来的代谢负担会导致宿主细胞容易耗竭,实际所需表达蛋白的产量损失甚至宿主细胞原始功能丧失。此外,为了维持细菌胞体内质粒的稳定存在,须使用抗生素或其他选择性药剂,从而增加了整个生物加工的成本,同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来,染色体表达同源或异源基因方式具有遗传表达稳定性强,对宿主细胞代谢负担小等优势,细菌染色体表达在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。但如何将目标基因整合到单个细胞染色体靶向位点中,并能在宿主菌正常生理状况下,以个体独立调控条件下稳定遗传表达外源基因?有待进一步深入研究。在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子,常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、核酸内切酶以及重组酶系统,其中CRIM(conditional-replication,integration,and modular)质粒-宿主系统就是其中一个经典的分子操作技术。CRIM质粒一宿主系统为噬菌体衍化的分子整合操作技术,其能够将目标基因整合到细菌细胞染色体靶向位点(噬菌体附着位点attB)中,并能在宿主菌正常生理状况下,以个体独立调控条件下稳定遗传表达外源基因。利用CRIM系统构建表达稳定携带有绿色荧光蛋白(GFP)作为筛选标签的重组大肠杆菌益生菌Nissle1917。根据pGFPmut3.1质粒序列设计一对扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因的引物,从pGFPmut3.1质粒DNA中扩增出GFP编码序列并将其克隆入CRIM质粒pCAH63中,化学法转化入含有pir编码蛋白(pir+)工程菌感受态中扩大培养,构建表达GFP的pCAH63GFP重组质粒。然后将pCAH63GFP重组质粒电转化导入含有辅助性质粒Nissle1917/pINT-ts感受态中,通过辅助性质粒pINT-ts上表达的入噬菌体特异性整合酶的特性将pCAH63GFP质粒整合入大肠杆菌Nissle 1917基因组中。而后于42℃过夜培养,消除pINT-ts辅助性质粒,通过Western blot检测到重组质粒pCAH63GFP能表达GFP蛋白,荧光显微镜可以检测到Nissle1917::p63GFP整合菌能够产生GFP荧光。本试验构建出能够稳定携带且表达直观的筛选标签GFP荧光蛋白的重组模式益生菌Nissle1917,为该重组菌靶向在体内示踪研究奠定基础。仔猪断奶后腹泻(PWD)和水肿病(ED)为养猪业临床上常见的疾病,主要病原菌为F4和F18菌毛表达阳性的产肠毒素大肠杆菌(ETEC),该病原菌首先通过菌毛黏附、定植易感肠道上皮细胞后,引起仔猪感染发病导致仔猪腹泻和高死亡率,体重降低,生长缓慢等,其药物治疗费用大。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗,但随着养殖业耐药菌的广泛产生,开发新的防控措施和策略迫在眉睫。将黏附素基因整合入无致病性大肠杆菌或大肠杆菌益生菌的基因组,持续稳定表达功能性黏附素,旨在增强大肠杆菌的粘附、定植能力,优先占据肠道上皮细胞的黏附结合,且有效而直接阻断病原大肠杆菌的肠道感染,旨在开发一种新型口服活疫苗株。因此,我们试图改造无菌毛的大肠杆菌工程菌SE5000和大肠杆菌益生菌EcNc,使之分别在菌体表面表达和展示ETEC的K88ac菌毛抗原和F18ab菌毛。在实施过程中,我们使用CRIM质粒宿主系统通过位点特异性重组分别将K88ac菌毛操纵子基因和F18ab菌毛操纵子基因整合到菌株大肠杆菌SE5000和EcNc的染色体中。使用SDS-PAGE和Western印迹分析整合重组菌SE5000::p63K88的全菌裂解物,能检测到27kDa的FaeG主要结构蛋白条带。玻板凝集试验测试EcNc::p63F18与抗F18ab兔多抗血清有明显可见的凝集反应。体外细胞粘附试验表明,整合重组菌株能够提高菌株对猪肠道细胞的粘附性能,尤其是SE5000::p63K88重组菌株有较好的粘附性能,且实验室自制的抗K88ac兔多克隆抗体能够抑制SE5000::p63K88对IPEC-J2细胞的粘附能力。上述数据表明,K88ac菌毛和F18ab菌毛整合在工程大肠杆菌SE5000和大肠杆菌益生菌EcNc中,稳定和功能性表达,为开发高效靶向的益生菌活疫苗奠定基础。常规的整合操作技术和分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势,但也都存在着自身的局限性,如长片段基因难以整合,效率低,脱靶率高等。最近几年,CRISPR/Cas(CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)and CRISPR-associated(Cas)genes)系统正在发展成为生命科学和医学生物学领域的革命性生物技术。CRISPR/cas系统由古细菌的免疫系统衍生而来,现在被广泛用于各种生物体细胞的基因编辑中。本研究使用CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌Nissle1917无质粒克隆株染色体进行外源大片段DNA基因片段(包括F4菌毛操纵子编码基因长约8Kb,和F18菌毛操纵子编码基因长约5.6Kb)的整合。基于本实验室制备获得的益生菌Nissle1917无质粒克隆株EcNc(缺失了细菌自身的两个隐秘性质粒pMUT1和pMUT2)细菌染色体基因组序列背景清晰的基础上,选择其基因组上非必需基因(yjcS,pcadA,lacZ,yieN/trkD,maeB,nth/tppB)内的位点X作为插入位点,使用CRISPR/cas9双质粒系统构建含大肠杆菌F18或F4菌毛操纵子基因,其两侧带有插入位点同源臂的CRISPR/cas9重组质粒pTargetT-X::PtetF18/F4。进一步将重组质粒pTargetT-X::PtetF18/F4转化入表达cas9蛋白的重组Nissle1917/pCas宿主菌,鉴于pCas质粒上表达cas9蛋白,结合重组质粒pTargetT-X::PtetF18/F4上的利用sgRNA靶向指导cas9切割酶特异性切割靶标位点和同源重组酶(Gam、Exo、Bet)活性作用,以导入的同源片段为模板实施同源重组,完成F18或F4菌毛操纵子基因整合进EcNc基因组的对应的位点。而后使用IPTG诱导启动pCas质粒上IPTG诱导依赖性启动子(Ptrc),从而启动ptrc启动子下游的靶向于pTargetT-X::PtetF18/K88质粒上的pMB1复制子的sgRNA(sgRNApMB1),高效切割pTargetT质粒上复制起始位点(pMB1),从而消除上一轮的pTargetT-X::PtetF18/K88质粒,同时消除壮观霉素抗生素筛选标志,在完成计划上述多轮的整合重组反应后,在42℃培养,消除温度敏感性pCas质粒,最终获得不含任何抗生素抗性基因且表达F18和F4菌毛的重组Nissle1917大肠杆菌无质粒克隆株。进一步选取已获得的两株整合重组菌,即表达F4菌毛的EcNc△nth/tppB::PtetF4(nth位点整合株)和同时表达F4和F18菌毛的EcNc△yjcS::PtetF18△pcadA::PtetF18△lacZ::PtetF 1 8△yieN/trkD::PtetF 1 8△maeB::PtetF4Anth/tppB::PtetF 4(yjcS,pcadA,lacZ,yieN/trkD,maeB,nth/tppB的六位点整合株),进行下述的功能性测试。上述两株重组菌株通过无抗性培养基多代(至少30代)培养后,Western blot检测验证,重组菌能稳定遗传功能性表达F4或(和)F18菌毛,生长周期曲线与原型亲本株一致,且该方法不会影响宿主菌已知的如生长速度等生物学特性。通过体外细胞粘附实验该重组菌能够有效提高重组菌对肠道上皮细胞(IPEC-J2和IPEC-1)的粘附性能,经两次口服免疫8周龄BALB/c小鼠动物实验,二免14天后产生抗F18菌毛和F4菌毛主要亚单位FaeG蛋白的IgG滴度的免疫血清,且其血清能显著降低病原菌F18+和F4+菌株(如猪场田间分离株8516和强毒菌株3030-2)对猪肠道传代上皮细胞IPEC-J2的粘附。进一步进行F4/F18敏感的20日龄仔猪口服免疫试验,用nth位点整合重组菌株和多拷贝整合重组菌株口服免疫的仔猪均能够产生抗F4 IgG抗体应答,多拷贝整合重组菌株免疫的仔猪所获得的血清能提高抗F18 IgG抗体应答水平。强毒株感染保护试验结果表明,免疫nth位点整合重组菌株和多拷贝整合重组菌株能够防止60日龄的仔猪腹泻,其保护率分别为100%和66.67%。上述重组整合菌株有望成为构建抗仔猪断奶后腹泻和水肿病的益生菌活疫苗候选株。本论文所构建的重组整合菌株的制备有望成为构建抗F4+及F18+菌株引起的仔猪断奶后腹泻和水肿病益生菌活疫苗候选株的方法,有望实现新型益生菌活疫苗候选株的制备,对仔猪断奶后腹泻和水肿病的防控提供新思路和策略。本论文所构建的整合重组菌菌株所用的分子操作的方法(CRIM质粒-宿主系统及CRISPR/cas9系统)可以为改造修饰其他菌株的染色体提供参考。