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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作为致死率最高的三大肿瘤之一，化疗是其重要治疗手段。然而肝癌患者由于ABC转运体家族成员过表达等因素产生的多药耐药现象(multi-drug resistance，MDR)是目前化疗失败的重要原因之一。由ABCB1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是目前研究最为广泛的ABC转运体，介导了包括肝癌在内的多种癌症多药耐药。然而针对P-gp开发的小分子抑制剂，绝大部分在临床应用上因毒性等问题均以失败告终。因此如何安全有效的抑制P-gp并成功攻克MDR成为目前亟需解决的问题。 MicroRNA(miRNA)是一类内源性，调节性小RNA分子，广泛参与各种生理病理过程，并且和肿瘤的发生发展密切相关。本研究结合生物信息学方法、CRISPR-CAS9介导的基因编辑技术、流式细胞术等方法，经体外筛选及功能验证实验发现miR-491-3p可显著调节P-gp介导的肝细胞癌化疗敏感性。上述结果提示，miR-491-3p可能在P-gp介导的肝癌多药耐药中发挥重要作用。因此，本课题针对miR-491-3p靶向基因调控的分子机制和功能进行深入系统的研究。 机制研究表明:1）miR-491-3p可直接靶向Hep3B细胞中ABCB13UTR，在转录后水平抑制ABCB1表达;2）miR-491-3p同时直接靶向ABCB1上游转录因子Sp33UTR，进而在转录水平抑制ABCB1的表达。3）肝细胞系和肝癌临床样本分析均显示miR-491-3p和ABCB1，Sp3的表达水平呈现负相关。 功能研究表明:1）流式检测发现miR-491-3p能增加细胞内药物蓄积，从而增强Hep3B细胞对化疗药物盐酸阿霉素(Doxombicin，DOX)和硫酸长春花碱(Vinblastine sulfate，VBL)的敏感性;2）无论是外源转入miR-491-3p抑制剂还是采用CRISPR/Cas9技术敲除内源miR-491-3p，均导致SMMC-7721，BEL-7402，Hep3B细胞内药物蓄积减少。3）过表达ABCB1或Sp3均能逆转Hep3B细胞中miR-491-3p介导的药物增敏作用。 综上所述，本研究表明miR-491-3p可直接靶向ABCB1及其上游转录因子Sp3，同时在转录和转录后水平调节ABCB1表达，进而增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性。本研究首次发现了rniR-491-3p/Sp3/ABCB1调节轴在肝癌多药耐药中发挥了重要作用，揭示了非编码miRNA更有效的双重调控分子新机制，进一步为miR-491-3p的可能的临床应用奠定了理论基础。