癫痫发病机制一直还未完全阐明,但癫痫的发生、发展与神经递质特别是兴奋性氨基酸(EAAs)神经递质及氧化、羰基紧张密切相关。本研究从癫痫发生、发展的促发因素入手,研究癫痫的预防和治疗,既研究抑制兴奋性毒性又考虑清除毒性羰基。拉莫三嗪(LTG)是一种新型的抗癫痫药物,它的化学结构和作用方式都代表了癫痫治疗的新途径。该药主要通过阻断兴奋性电压依赖性钠通道发挥抗癫痫作用,同时也可降低钙内流或通过某些尚未明确的作用机制发挥广谱抗癫痫作用。有研究表明,LTG能调节谷氨酸在突触前膜的释放,多年来倍受关注。而牛磺酸、γ-氨基丁酸(GABA)本身是两个抑制性氨基酸(IAAs)神经递质。具有很重要的抑制兴奋的生理功能。本论文采用活体微透析技术,配合高灵敏的检测手段,研究不同自由活动清醒致痫模型鼠的海马神经元间隙主要兴奋性氨基酸类(EAAs)活性递质动态释放和LTG干预治疗的影响,考察LTG对不同致痫模型的神经保护作用,并特别考察了所建立的新生鼠惊厥模型的神经保护作用,扩展了新生儿用药的药理作用及安全性;探讨了LTG、牛磺酸和GABA抗羰基的作用及机制。进一步阐述了LTG、牛磺酸和GABA抗癫痫的作用机制。本研究为LTG临床上更有效更广泛地运用新型抗癫痫药进行抗癫痫的药物治疗提供了新的实验依据,为癫痫的治疗提供了新的治疗策略,为新药开发的结构设计提供了新的思路。主要研究的内容如下:　　 1、考察了拉莫三嗪对持续性癫痫、慢性点燃癫痫模型干预治疗后,EAAs活性神经递质在自由活动的清醒大鼠生理及病理状态下脑组织癫痫病灶的释放的影响。本研究以戊四氮(PTZ)为致痫剂,建立持续性癫痫、慢性点燃癫痫模型,运用脑内在体微透析技术结合高效液相(HPLC)检测获得了较为满意的结果;在持续性癫痫、慢性点燃癫痫大鼠模型里,主要的EAA神经递质基础水平在癫痫大鼠海马神经元间隙液明显升高,相对正常组都有显著差异,且慢性点燃癫痫模型的EAA高于持续性癫痫模型;两种模型组给予20mg/kg LTG预防或治疗后,其组织间隙细胞外EAA浓度显著下降,由此说明急性应用LTG对中枢神经系统主要的EAA的释放有抑制和预防保护作用。托吡酯(TPM)是新型EAA受体拮抗剂,而LTG是EAA调节剂。急性应用LTG和TPM干预慢性点燃癫痫模型后,发现两种抗癫痫药都对慢性点燃癫痫模犁抑制EAA神经递质具有显著治疗效果,然而控制效果LTG优于TPM,说明LTG与谷氨酸受体拮抗剂托吡酯都具有很强的抑制EAA释放的治疗效果,但EAAs的调节释放优于受体拮抗。　　 2、考察了不同剂量(分别为5、10、20和40 mg/kg)拉莫三嗪对围产期新生鼠药物诱导惊厥模型EAAs活性神经递质在自由活动的清醒新生鼠生理及病理状态下脑组织病灶中释放的影响,跟踪观察了其远期脑组织苔藓纤维发芽,并与反复惊厥模型EAA的释放变化进行了比较。本研究以戊四氮为致痫剂,建立急性惊厥模型,运用脑内在体微透析技术结合HPLC法分析,得到的结果表明,通过新生鼠单次惊厥模型与反复惊厥模型EAA浓度变化的比较,发现PTZ单次大剂量诱导对敏感期新生鼠的兴奋性影响非常大,但这两种惊厥模型中哪一种对神经元的损伤程度大还需进一步的阐述。用不同剂量干预单次惊厥模型,通过比较主要EAA的释放,发现10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg三种剂量部分或全部监测时间点都有显著的治疗效果,但相互之问没有显著性差异,而40 mg/kg LTG剂量相对于5 mg/kg的剂量部分时间点有显著性差异,说明作用疗效与剂量有关,且20 mg/kg剂量为最佳治疗量。通过急性应用20 mg/kg拉莫三嗪对单次惊厥模型干预后的远期脑组织苔藓纤维发芽进行观察,发现单次惊厥在齿状同颗粒上层的苔藓纤维发芽分数显著高于正常鼠和20 mg/kg拉莫三嗪干预组,说明20 mg/kg拉莫三嗪具有远期神经保护作用。　　 3、考察缺氧惊厥模型围产期缺氧后及LTG干预后未成熟鼠脑内的EAA浓度的动态变化,跟踪观察其远期脑组织苔藓纤维发芽和测定学习记忆能力,探究单纯急性缺氧对未成熟鼠的近、远期影响;并进一步与促红细胞生成素(EPO)干预后的相应结果进行比较,从而评价LTG干预新生鼠的近、远期疗效并探讨其作用机制。利用上述围产期新生鼠PTZ致痫模型中主要兴奋性氨基酸的浓度变化的数据,考察了缺氧引起惊厥模型与PTZ致惊厥EAA的差异。研究结果表明,从兴奋毒性考虑,缺氧EAA的浓度很高,显著高于PTZ致痫的EAA浓度,并有延长效应。LTG作为EAA调节剂用于缺氧惊厥的治疗,从机制上看,是潜在的良好的神经保护作用的药物而可用于治疗围产期缺氧惊厥导致的脑损伤。从实验结果可知,单次常氧注射20 mg/kg LTG具有一定的安全性,在近期及远期均未显示明显的神经元丢失,未见苔藓纤维发芽,在学习记忆能力方面未见下降,且癫痫发作敏感性升高。20 mg/kg LTG能迅速显著地减少围产期缺氧后的EAA浓度的释放;在P30,Y-型电迷宫测试中LTG干预组达到学会标准所需次数明显少于缺氧-NS组;24小时记忆保持率均高于缺氧-NS组;尼氏染色显示各组在P10、P30两个时间点均未见明显脑神经元丢失现象;在P30，Timm染色结果显示,缺氧-LTG组在齿状回颗粒上层的苔藓纤维发芽分数较缺氧-NS组明显降低,说明单次应用20 mg/kg LTG后,对缺氧惊厥导致的远期学习和记忆能力的下降及对致痫药物的耐受性的降低等不良后果有所改善,降低了惊厥易感性;LTG可能主要通过持续显著地降低围产期缺氧后EAA浓度的释放,从而减少EAAs的兴奋性毒性作用,最终起到远期神经保护作用,但不是唯一的因素;本研究还选用安全性良好的生物制品EPO与LTG的干预治疗进行比较,EPO也能显著地减少EAA的释放,但不能完全抑制苔藓纤维发芽,也就是说不能完全阻止癫痫的远期发展趋势。相对来说,单次20 mg/kg LTG阻止了围产期缺氧惊厥远期发展为慢性癫痫的发展趋势,在这一点上,更优于EPO。总之,LTG对围产期缺氧惊厥具有近期和远期的神经保护作用,且具有一定安全性。　　 4、考察了LTG、牛磺酸和GABA分别对癫痫模型过氧化的神经保护作用。本研究拟以PTZ为致痫剂,建立急性癫痫模型,通过研究MDA、SOD等来考察LTG、牛磺酸和GABA对癫痫模型抗氧化、羰基应激的作用效果。研究结果可知,在大脑海马及皮质和血清里,模型组MDA的含量升高,SOD酶的活性降低,在大脑海马及皮质,GSH-Px和Na+K+-ATP酶的活性降低。LTG、GABA和牛磺酸都能显著降低大脑皮质和降低海马和血清MDA的含量,显著提高大脑皮质和海马的SOD、GSH-Px的活性,且三组干预组之间没有显著性差异,与正常组也没有显著性差异;LTG、GABA能提高Na+K+-ATP酶的活性,有效控制癫痫的发作,但牛磺酸对Na+K+-ATP酶的效果较弱,且与LTG、GABA干预组有显著性差异。以上结果表明:LTG、牛磺酸和GABA都对癫痫模型具有清除自由基、抑制脂质过氧化、保护神经组织的作用,但控制癫痫的发作LTG、GABA比牛磺酸强。　　 5、考察了牛磺酸和GABA抗羰基应激的机制。研究它们在生理条件下能否与丙二醛(MDA)反应,从而保护组织蛋白免于活性如MDA的氧化修饰。牛磺酸和GABA是神经系统的重要抑制性神经递质,谷氨酸和天冬氨酸是神经系统的主要的兴奋性神经递质,考虑癫痫病灶内源性的氨基酸神经递质是否具有清除毒性羰基化合物的作用,故同时假设Glu、Asp也具有清除如MDA的活性羰基化合物的功能,并与牛磺酸和GABA的清除能力进行比较。MDA是氧化紧张、脂质过氧化的典型羰基中间体。研究结果表明:在生理条件下牛磺酸、GABA、谷氨酸和天冬氨睃与MDA温浴24h直接诱捕MDA,经HPLC、质谱(LC/MS)等分析手段分析,发现牛磺酸和GABA与MDA直接反应比较快,而Glu和Asp较慢,通过HFLC分离,主要生成两种产物,一种是没有荧光的紫外吸收峰为274～278 nm的产物,一种是有荧光的产物,这种类似脂褐素(Ex392-395 nm/Em456-364 nm)的荧光产物是1,4-二氢吡啶衍生物;而谷氨酸和天冬氨酸与MDA在生理条件下反应,通过分析,谷氨酸和天冬氨酸都只生成一种非荧光产物。牛磺酸和GABA与不饱和脂肪酸一起培育后含量的下降及MDA含量的减少,说明牛磺酸和GABA在生理条件下具有强抗羰基毒性的功能。牛磺酸和GABA,这两种IAAs神经递质,又可作为抗氧化剂,抑制氧化紧张时活性羰基中间体的形成。研究数据表明,牛磺酸和GABA具有很强的清除内源性和/或外源性不饱和活性羰基的能力。相对而言,EAAs神经递质Glu和Asp清除功能较弱,这与氨基酸本身的结构密切相关。此外,通过牛磺酸与MDA、BSA反应,可知牛磺酸能抑制蛋白羰基化的形成。由上述结果可知,牛磺酸可进一步抑制AGEs/ALEs的形成。牛磺酸和GABA抑制羰基/氧化紧张的机制也许对抑制神经组织和与衰老、癫痫、神经退行性疾病如帕金森病(PD)、老年痴呆(AD)等相关的化学修饰是有用的。　　 6、本研究还初步探讨了拉莫三嗪清除活性羰基的机制。拉莫三嗪与MDA直接反应,通过LC/MS分析生成新的产物,推测丙二醛与拉莫三嗪上的两个氨基结合成环或与一个氨基结合形成烯胺。由此说明,具有氨基的抗癫痫药物具有清除活性羰基的功能。